[发明专利]一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过离体培养白桦花药获得单倍体再生植株的方法。本发明属农业生物技术领域。

背景技术

白桦(Betula platyphylla)为桦木科桦木属落叶乔木。自然分布主要在东北地区的北部：大小兴安岭、完达山等林区。因其姿态优美，树皮光滑洁白，作为庭园树、行道树及街心绿地栽培，具独特的观赏价值。白桦属强阳性树种，耐贫寒、生长快、材质优良，为重要工业用材树种之一。

花药培养能够获得纯系育种材料，进行单倍体育种，缩短育种年限和提高育种效率，而且在基础生物科学领域具也有广泛应用(王延玲等，山东农业大学学报(自然科学版)，2006，37(1)：149～151)。花药培养建立的双单倍体群体DH群体，具有遗传学上的纯合基因组，是AFLP,RAPD,SSR等分子标记和基因图谱的理想材料，能极大提高基因定位、标图的准确性。从20世纪60年代，Nitshc通过花药培养得到烟草的单倍体植株后，花药培养得到了很大的发展并于70年代达到了高速发展阶段。自1964年印度的Guha和Maheshwari(Guha and Maheshwari,Nature,1964,204:497)首次成功地从毛叶曼陀罗离体花药培养中获得单倍体植株，并随后证实是由胚状体途径获得的单倍体花粉植株，从此开创了利用花药培养诱导单倍体的新途径。之后，花药培养诱导单倍体在许多重要作物上获得成功，如在小麦(倪胜利等，甘肃农业大学学报，2004，39(2):141～145)、玉米(付迎军，延边大学农学学报，2004，26(1)：1～5)、水稻(赵海岩等，辽宁农业科学，2005(1)：5～7)、茄子(Miyoshi，Plant Cell Reports，1996，15(6)：391～395)、草莓(Rosati等，Hort Science，1975，10(2)；119～120)等农作物上都有成功的报道。

到目前为止，白桦花药培养体系及单倍体植株还未有报道。由于小孢子处于单核靠边期的白桦花药很小，约1.5-2.0mm，无菌接种操作较困难。根据相关研究研究报道(李同华，东北林业大学硕士论文，2004)，白桦小孢子在每年的8月下旬发育到小孢子，9月份完发育到单核靠边期越冬，第二年再继续发育成熟。本发明的目的是建立一种培养白桦花药获得单倍体的技术体系，为白桦单倍体育种及基础研究提供原始研究材料。

发明内容

本发明主要涉及快速获得大量小孢子处于单核靠边期的白桦花药，花药植株再生及单倍体植株的鉴定。具体如下：

(1)小孢子处于单核靠边期白桦花药的大量获得

在8月下旬到9月初，不断取材，利用醋酸洋红法于光学显微镜下观察花药中小孢子的发育时期。当小孢子发育到单核靠边期时,采集雄穗在超净工作台内用70％消毒3分钟。普通豆浆机的刀片和杯也事先在超净工作台内经70％酒精经消毒后，将花穗放入豆浆机的杯中，拧上刀片，然后拿出超净工作台，插入电机粉碎。之后取下杯和刀片在超净工作台内打开，取出物分别以40目和60目网筛过筛，除去大于和小于花药的杂质获得大量无杂质、无菌花药。

(2)花药植株再生

将上述花药接种到添加40g/L蔗糖和0-3.0mg/L 2,4-D，0.5mg/L KT的MS培养基中诱导愈伤组织。培养四周，在40mg/L蔗糖+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT条件下获得大量愈伤组织。然后转入添加0.5-2.0mg/L BA，0.1-0.5mg/L NAA，30g/L蔗糖的MS培养基进行分化。培养四周后，在30mg/L蔗糖+2.0mg/L BA+0.5mg/L KT最多。分化出的不定芽在WPM+0.4mg/L IBA+0.2mg/L NAA培养基中诱导生根培养。

(3)单倍体植株的鉴定