[发明专利]一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及动物细胞培养领域，尤其涉及一种猪脂肪干细胞分离培养及 鉴定的方法。

背景技术

胚胎干细胞的研究遇到伦理、法律的瓶颈之后，成体干细胞日益成为研 究的热点。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)是存在于脐带血、 骨髓、肌肉、皮肤和脂肪等组织中的一类成体干细胞，MSCs来源可靠，具有 自我更新，且具有向多种组织分化潜能，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、 神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells， 脂肪干细胞)是近年来从脂肪组织中分离得到的一类成体间充质干细胞，具 有自我更新及向分化潜能。脂肪干细胞由于具有安全、易获得、可迅速扩增 和多向分化能力等特点使其成为现有干细胞生物工程研究的最理想来源。目 前临床上已利用这种细胞进行基因治疗、干细胞治疗及骨组织工程的修复等， 在再生医学领域具有广泛的应用前景。

2006年，国际细胞治疗协会(间充质干细胞委员会)(Mesenchymaland TissueStemCellCommitteeoftheInternationalSocietyforCellularTherapy)认 为人类的MSCs的必须满足以下三个条件：(1)在标准的细胞培养条件下， MSCs必须具备可贴壁性生长；(2)MSCs应该高表达CD73、CD90、CD105； 而应低表达或不表达CD14、CD45、CD11b、CD34、CD79、CD19以及人白 细胞抗原(HLA-DR)。(3)在特定的诱导液培养下，MSCs必须具有向骨、 脂肪和软骨分化的能力。由于目前脂肪干细胞并没有特定的表面标志，因此 对它们的鉴定主要采用流式细胞仪检测细胞表面标志和将脂肪干细胞进行成 脂、成骨和成软骨的诱导分化来确定它们是否为脂肪干细胞。这是目前公认 的间充质干细胞鉴定方法。

在现有技术中，猪脂肪干细胞在体外连续培养后，容易老化，核型发生 改变、表面抗原发生变化、且多向分化能力仅局限于向成骨或成骨和成脂肪 细胞方向分化(Zhangetal.(2014).PLoSONE9(1)：e85089. doi：10.1371/journal.pone.0085089；Huangetal.StemCellResearch&Therapy (2015)6：77)，没有向成软骨细胞方向诱导成功的报道。脂肪干细胞的老化限 制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中研究和应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种遗传稳定性好，干性好，多向分 化性能好的脂肪干细胞培养的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种猪脂肪干细胞分离培养的方法，包括以下步骤：

1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤，细胞筛过滤后进行梯度离心，所述 的细胞筛过滤和梯度离心重复两次，然后进行细胞培养，

所述消化采用LiberaseTL进行，所述消化的温度为37℃，时间为1～3h； 所述的LiberaseTL的浓度为15～25μg/mL，LiberaseTL与脂肪组织的体积比 为0.5～1∶1；

2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

优选的，步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤：

采集猪脂肪组织；

将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎，所述清洗采用的清洗液为含有 0.45～0.5g/L青霉素和0.6～1.0g/L链霉素的PBS溶液。

优选的，所述的脂肪组织消化后还包括终止消化，所述终止消化具体为：

使用含体积分数为7.5～15％FBS的低糖DMEM培养液终止消化，所述的 低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

优选的，所述的细胞筛过滤按照时间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛 过滤；

所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm，所述第二细胞筛过滤中 细胞筛的孔径为70μm。

优选的，所述的梯度离心按照时间顺序包括第一离心和第二离心；

所述第一离心的转速为1000～1400rpm，所述第一离心的时间为8～12min；

所述第二离心的转速为8000～1200rpm，所述第二离心的时间为8～12min。