[发明专利]一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测VEGF的新方法，尤其是晚期结直肠癌患者外周血循 环肿瘤细胞VEGF的方法。

背景技术

对于晚期结直肠癌患者，靶向联合化疗可以明显延长晚期结直肠癌无病 无进展生存期和总生存期。晚期结直肠癌患者临床目前应用的靶向药物中血 管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)受体抑制 剂贝伐单抗(Bevacizumab)在临床实践中取得了显著的疗效。

VEGF是一种正常细胞和肿瘤细胞都可产生的同型二聚体糖蛋白，并且在 血管生成过程中发挥重要作用。VEGF表达水平在肿瘤组织明显高于非肿瘤组 织。VEGF是迄今所发现的最重要的促血管生成因子，它可通过血管内皮上的 受体(VEGFR)介导的受体信号转导通路，促进血管内皮细胞增殖、迁移，阻 止血管内皮细胞凋亡和管腔网状结构退化，增加血管渗透性。

人的VEGF基因由8个外显子和7个内含子构成，其mRNA通过不同的剪切方 式，编码为不同的VEGF亚型，包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-D和VEGF-E，其中 VEGF-A缺失外显子6，而VEGF-B缺失外显子6和7。研究发现人体组织和肿瘤中 主要以VEGF-A和VEGF-B为主。VEGF受体(VEGFR)为酪氨酸激酶受体，分为 VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3，除此之外，VEGF还有两个辅助受体，分别为 Neuropilin-1(NRP1)和Neuropilin-2(NRP2)。不同VEGF可以与其不同受体 相互作用。VEGF-A是血管形成因子家族中最重要的成员，其作用于跨膜的酪 氨酸激酶受体VEGFR-1和VEGFR-2。与配体结合后，受体产生二聚作用并引起 胞质激酶的自身磷酸化，对下游信号分子产生作用。在正常的内皮组织中， VEGFR的表达较低；而在肿瘤组织中其表达水平明显升高。肿瘤新生血管为营 养物及氧气进入肿瘤组织，将代谢产物运出组织细胞外，并为肿瘤的转移提 供了基本条件。VEGF-A主要通过激活在肿瘤血管中过度表达的VEGFR-2起作 用。由于VEGF-A在肿瘤发生过程中的重要地位，目前已成为抗血管生成治疗 的靶点。

目前VEGF检测的主要为免疫组织化学方法，通过检测结直肠癌组织标本 中的VEGF蛋白表达情况判定VEGF状态。该方法应用广泛，但目前主要应用于 组织标本的染色检查。而对于晚期无法获取组织标本的结直肠癌患者，VEGF 的表达状态评估变得困难。

发明内容

循环肿瘤细胞(Circulatingtumorcell，CTC)是从实体肿瘤脱落进入 外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外 周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是 晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC 检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

目前临床对于不能获取临床病理标本的晚期结直肠癌患者治疗仍为经验 性用药，而不能进行针对性的靶向治疗。为了克服晚期结直肠癌患者不适宜 组织标本取材，进而无法评估患者VEGF表达状态的不足，本发明提供了一种 晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞VEGF的检测方法：利用膜过滤装置分 离获取晚期结直肠癌患者外周血中的CTC；运用细胞蜡块技术制作薄层切片； 进而检测结直肠癌患者VEGF基因表达情况。

本发明采用的技术方案如下：

一、利用膜过滤装置分离获取晚期结直肠癌患者外周血中的CTC：

1、采集晚期结直肠癌患者外周血：肘正中静脉血5ml；

2、外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分：1mmol/l EDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定终浓度为 0.25％；

3、利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循环肿 瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样容器中， 使其依靠重力自然过滤；

4、过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器，将循环肿瘤细 胞染色液A液0.5ml加入到滤器中，染色3min，PBS缓冲液冲洗干净；滤液 过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，纯水1ml，冲洗2次，取下滤膜，放 置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。