[发明专利]一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法

权利要求书

1.一种晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检测方法，其特征在 于，检测方法步骤如下：利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本的晚 期结直肠癌患者外周血中的CTC，运用细胞蜡块技术制作薄层切片，进而 检测无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者外周血CTC的EGFR表达情况。

2.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检 测方法，其特征在于，所述的膜过滤装置包括滤器(3)、血样容器(2)、 废液缸(5)和铁架台(1)，所述铁架台(1)设有底座(11)、立架(12) 和支架(13)，所述血样容器(2)通过支架(13)设置于铁架台(1)上 部，血样容器(2)的下方为滤器(3)，滤器(3)通过输液器(4)联通 至废液缸(5)，废液缸(5)设置于底座(11)上。

3.根据权利要求2所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检 测方法，其特征在于：所述滤器(3)包括滤器上口(6)、滤膜(7)、载 滤膜平台(8)和滤器下口(9)，滤膜(7)置于载滤膜平台8上；滤器上 口(6)接血样容器(2)，滤器下口(9)通过输液器(4)接废液缸(5)。

4.根据权利要求3所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检 测方法，其特征在于：所述滤膜(7)为疏水材料制成，其上均匀布满口 径为10微米的滤孔(10)。

5.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检 测方法，其特征在于，所述的利用膜过滤装置分离获得无法获取组织标本 的晚期结直肠癌患者外周血中的CTC，方法步骤如下：

1)采集晚期结直肠癌患者外周血：肘正中静脉血5ml；

2)外周血样预处理：将采集的外周血样10倍稀释，稀释液成分： 1mmol/lEDTA+0.1％BSA,稀释后加多聚甲醛固定外周血样10分钟，固定 终浓度为0.25％；

3)利用膜过滤分离肿瘤细胞装置过滤外周血样，分离获得外周血循 环肿瘤细胞：将预处理的外周血样加入到膜过滤分离肿瘤细胞装置的血样 容器(2)中，使其依靠重力自然过滤；

4)过滤结束后，从膜过滤分离肿瘤细胞装置中取下滤器(3)，将循 环肿瘤细胞染色液A液0.5ml加入到滤器(3)中，染色3min，PBS缓冲液 冲洗干净；滤液过滤完全后加入B液，1ml，染色2min，取下滤膜(7)， 放置在载玻片上，干燥后在显微镜下观察，确定是否存在CTC。

6.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检 测方法，其特征在于，所述的运用细胞蜡块技术制作薄层切片，步骤如下：

1)脱色：将带有CTC的滤膜(7)从载玻片上取下，置于脱色液中浸 泡4-6小时，脱去CTC染色液，所述脱色液为：95％酒精与100％二甲苯按 1:1混匀。

2)包裹：浸泡结束后取出滤膜(7)，用显微镜擦镜纸或滤纸包裹；

3)固定：将包裹物置于10％中性福尔马林中，固定4-6h；

4)浸蜡包埋：固定结束后取出包裹物，脱水后置于石蜡包埋盒中，浸 蜡包埋制作细胞石蜡块；

5)薄层切片：用切片机将细胞石蜡块连续切片，制成厚度为4μm的 薄层切片。

7.根据权利要求1所述的晚期结直肠癌患者外周血循环肿瘤细胞EGFR的检 测方法，其特征在于，所述的检测无法获取组织标本的晚期结直肠癌患者 外周血CTC的EGFR表达情况，步骤如下：

1)将CTC蜡块薄层切片在染色缸中按以下步骤进行脱蜡和水化：二 甲苯溶液浸泡3次，每次10分钟；无水乙醇溶液浸泡3次，每次5分钟； 95％乙醇溶液浸泡5分钟；85％乙醇溶液浸泡5分钟；75％乙醇溶液浸泡5 分钟；蒸馏水浸泡2次，每次3分钟；PH＝7.4的PBS浸泡3次，每次3分 钟。

2)采用柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法对组织抗原进行修复：取 pH＝6.0柠檬酸盐缓冲液800-1500ml于压力锅中，大火加热直至沸腾，将 脱蜡水化后的组织切片置于耐高温不锈钢切片架上，放入已沸腾的缓冲液 中，锅盖继续加热至喷汽开始计时，喷汽1-2分钟后，压力锅离开热源， 冷却至室温，取出玻片，先用蒸馏水冲洗两次，之后用pH＝7.2-7.4的PBS 冲洗两次，每次各3分钟；

3)3％H₂O₂去离子水孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS冲洗 3次，每次3分钟；

4)滴加EGFR一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS冲洗3 次，每次5分钟；

5)滴加通用型生物素化二抗，室温或37℃孵育60分钟，PBS冲洗3 次，每次2分钟；

6)应用DAB溶液显色：甩去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜 配制的DAB溶液，显微镜下观察5-10分钟；

7)蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片：蒸馏水冲洗2次，每次3分 钟；苏木素复染1分钟；0.1％盐酸酒精分化；0.1％氨水溶液返蓝；50％、70％、 85％、95％、无水乙醇脱水干燥；二甲苯透明，中性树脂胶封片；

8)细胞病理学专家阅片，根据细胞着色程度判定EGFR表达情况。