[发明专利]枯草芽孢杆菌及微生态制剂、饲料添加剂、预混料及饲料

说明书

本发明公开了一株具有多种产酶活性、酶活力较高的突变枯草芽孢杆菌菌株CGMCC No.9357及其应用。将来源于养虾池的菌株，作为出发菌株，对其进行紫外诱变，获得一株菌，其中性蛋白酶活力、中性木聚糖酶活力和中性纤维素酶活力较出发菌株分别提高到1.8倍、1.56倍和1.3倍，同时兼具淀粉酶活性。在海水和淡水中均有一定的酶活性，且具有一定的高温耐受性。

技术领域

本发明公开一株枯草芽孢杆菌菌株，及含有其的饲料添加剂及预混料，属于微生物技术领域。

背景技术

中国是水产养殖大国，高密度养殖带给养殖高收益的同时，仍存在亟待解决的问题：投饵、施肥、排泄物等引起水体严重污染，导致水产养殖的生态环境日趋恶化，水中生物耗氧量、亚硝酸盐、氨氮、硫化物等严重超标，病原微生物种类和数量上升，鱼虾病害不断增加，致使大面积死亡的事件时有发生。运用有效的微生态，促进水产动物的消化吸收功能，增强其免疫力，控制养殖水环境中氨氮、硫化氢等有害物含量，调控养殖池微生物生态结构。当前，预防病害是水产养殖业所面临的迫切课题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明筛选出了具有高产多种酶性能的菌株，包括蛋白酶、淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶等；较高热耐受性和高海盐耐受性的枯草芽孢杆菌，应用在水产养殖中，提饲料转化率，对鱼虾等水产动物具有保健作用。

本发明所述的枯草芽孢杆菌筛选方法，包括以下步骤：

(1)样品收集：收集福建、湖南、湖北、江苏、京津冀、辽宁等地鱼塘虾池的水样和泥样共计100份。

(2)拟芽孢杆菌的筛选：取1g泥样样品(水样直接备用)，加入90mL无菌水/150mL三角瓶，震荡30min。取5mL泥样悬液或水样，加入无菌试管中，85℃，10min，LB，37℃过夜富集。梯度稀释成10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，选择两到三个梯度涂布LB平板，两个平行，将平板倒置，37℃培养24h。对生长快的菌落大的菌株进行编号，转接到斜面，作为目标菌备用。

(3)不同盐度的产酶初筛培养基(根据水产养殖条件选择，3°、15°或28°的海盐水)

蛋白酶初筛培养基：脱脂奶粉10g，蛋白胨10g，1L海盐水，pH7.2-7.8，琼脂粉15g，113-115℃，13-15min。(脱脂奶粉溶液一瓶，与盐水和琼脂一瓶，1:1分开灭菌)

淀粉酶初筛培养基：酵母膏5g，可溶性淀粉15g，1L海盐水，pH7.2-7.8，琼脂粉15-25g，121℃，20min。

纤维素酶初筛培养基：酵母膏5g，羟甲基纤维素5g，1L海盐水，pH7.2-7.8琼脂粉15-25g，121℃，20min。

木聚糖酶初筛培养基：木聚糖，1.0-10g；酵母膏5g，1L海盐水，pH7.2-7.8琼脂粉15-25g，121℃，20min。

脂肪酶初筛培养基：酵母膏5g，蛋白胨10g，三丁酸甘油酯10g，1L海盐水，pH7.2-7.8琼脂粉15g，121℃，20min。

(4)菌株筛选及鉴定方法

蛋白酶定性筛选：将目标菌点接到蛋白酶初筛培养基平板(以下产酶初筛培养基平板统称为***酶板)，30℃培养24h，观察菌落周围是否出现透明圈，目测同一平板菌株圈径比相对大小。

淀粉酶定性筛选：点接目标菌于淀粉酶板上，30℃培养24h。加革兰氏染色中的典液，显色，为防止光分解，5min内观察。观察菌落周围是否出现透明圈，目测同一平板菌株圈径比相对大小。