[发明专利]一种竹节参齐墩果烷皂苷在制药中的应用

说明书

技术领域

本发明提供一种竹节参齐墩果烷皂苷的制药中的应用，具体是在抗炎类药物上的应 用。

背景技术

竹节参为五加科植物竹节参Panaxjaponicus.C.A.Mey.的根状茎及肉质块根，是我国名 贵中草药，具有补虚强壮、活血祛瘀、止血祛痰等功效。竹节参的主要有效成分为竹节参 皂苷，竹节参皂苷提取物主要以COS为主，尚有少量达玛烷型皂苷。药理研究显示竹节 参总皂苷具有抗炎等多种药理作用，但是COS及其抗炎机制的研究报道甚少。

发明内容

本研究在前期研究基础上，拟建立LPS致RAW264.7细胞炎症模型，探讨COS对 RAW264.7细胞的SIRT1活性影响及其抗炎作用，为竹节参的临床应用提供理论基础和实 验依据。

药品与主要试剂竹节参采购于湖北省恩施椿木营竹节参种植基地，经三峡大学湖北省 天然产物研究与利用重点实验室邹坤教授鉴定为五加科人参属植物Panaxjaponicus C.A.Mey。D101大孔吸附树脂(上海勤实科技有限公司)；人参皂苷Rg1(纯度>98％，成 都指标化纯生物技术有限公司)；小鼠RAW264.7细胞，细胞系购于中国科学院上海细 胞库；DMEM高糖培养基(Gibco公司)；胎牛血清(ScienCell公司)；脂多糖(LPS，Sigma 公司)；一氧化氮(NO)试剂盒(碧云天生物公司)；蛋白预染marker、RIPA细胞裂解液、和 BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；化学发光剂ECL(碧云天生物技 术研究所)；TritonX-100(Solarbio公司)；DAPI(武汉科瑞生物技术)；NF-κBp65 抗体(美国Cellsignaling公司)；β-actin、TNF-α、IL-1β抗体(美国Santacruz公司)； Sirt1抗体(美国Millipore公司)；PE标记山羊抗小鼠，FITC标记山羊抗兔(美国Santa cruz公司)。

主要仪器NU-4750E型二氧化碳培养箱(NuAire公司)，CKX41倒置显微镜(日本， Olympus公司)，NIKONTP1020倒置荧光显微镜(上海衡桥仪器有限公司)，CT15RT高 速冷冻离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)，Thermo全波长酶标仪(芬兰，Tecan Inpinifetm200)

方法

COS制备将1kg竹节参药材粉碎，加入10倍量体积分数为0.65的乙醇浸泡2h，加 热回流提取3次，每次2h，合并、减压回收、浓缩得竹节参醇提物；再进行水溶提取物， 用正丁醇萃取直到正丁醇层几乎无色为止，分离、合并、减压回收、浓缩得到正丁醇萃取 物，将萃取物上样到D101大孔吸附树脂上，用体积分数为0.95的乙醇进行梯度洗脱，将 所得到的洗脱物减压浓缩干燥，即得COS，得率为16.8％。精确称取干燥的COS粉末和 人参皂苷Re标准品各0.1g，置于容量瓶中，精密加入甲醇8ml，超声溶解，再加入甲醇 定容至10ml，摇匀过滤，加入到HPLC分析瓶中，记录COS的HPLC。应用HPLC进行 指纹图谱分析，并且应用标准品进行成分鉴定。实验前用DMSO溶解配成400mg·mL ^－1的母液，再用培养基稀释至所需质量浓度。

COS的HPLC分析色谱条件：色谱柱为YMC-packODS-AQ柱(250×4.6mm， 粒径5μm)；流动相为乙腈(A)-0.4％磷酸水溶液(B)；柱温30℃；洗脱方式为梯 度洗脱(0～5min，5％～5％A；5～20min，5％～30％A；20～30min，30％～30％A；30～ 50min，30％～85％A；50～60min，85％～85％A)；检测波长203nm；进样量10μL； 流速1.0ml·min^-1。

细胞培养RAW264.7细胞用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基培养，放置于37 ℃，5％CO2培养箱中，取对数期细胞用于实验。