[发明专利]线粒体靶向的基因编辑系统及方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及一种基因编辑系统及方法，具体涉及一种线粒体靶向的基因编 辑系统及方法。

[背景技术]

目前基因组定点编辑/修饰的基本原理是利用在靶位点区自发或诱发的 DNA双链缺口(double-strainbreaks,DSBs)，DSBs将激活细胞内的DNA修复 机制来进行基因组的改造，比如非同源区的末端连接(NHEJ)或是同源重组(HR) (附图1)。

在细胞内，乐观估计DSB自发产生的概率低于1/104，如果通过基因工程 采用spCas9和SaCas9等核酸酶诱发DSBs，效率可提高至10％以上，且具有位 点特异性，可在内源基因突变的位点诱发DSBs以便接下来的基因修复过程发 生。DSBs激活细胞内的DNA修复机制后，会有两种不同的修复机制竞争性的 参与DSBs的修复，一种是非同源区的末端连接(Non-homologousend joint-NHEJ)，一种是同源重组(Homologousrecombination-HR)。要实现基因组 的定点准确编辑，需要借助于同源重组修复机制。因此直接提高DSBs修复过程 中同源重组发生的频率或抑制非同源区的末端连接(NHEJ)都有助于提高基因 组定点编辑/修饰的效率。

人体基因组包括细胞核基因组和线粒体基因组两部分，细胞核基因组和线 粒体基因组的突变均可能导致人类遗传病。目前的基因编辑技术主要针对的是 细胞核基因组，因此开发针对线粒体基因组的基因编辑技术修复线粒体基因对 人类疾病的治疗同样有重要的意义。

要实现线粒体基因的编辑，需要将核酸酶特异性的定位于线粒体中。对于 CRISPR-Cas9系统而言，负责引导Cas9蛋白基因组定位的sgRNA同样需要进 入线粒体中方能让CRISPR-Cas9系统在线粒体中发挥作用。Cas9蛋白和sgRNA 的线粒体定位可以实现线粒体基因的敲除，但要实现线粒体基因的定点编辑， 还需要靶向线粒体的修复模板。

现有的基因定点编辑原理主要是同源重组修复机制，因此需要同源修复模 板。已有的报道指出，可以介导同源重组修复的模板可以是双链DNA、DNA寡 核苷酸链或RNA模板。双链DNA和DNA寡核苷酸链难以实现线粒体定位， 但借助于线粒体靶向的RNA信号可以实现RNA模板的线粒体定位。

[发明内容]

本发明的目的在于借助于线粒体靶向的RNA信号实现RNA模板的线粒体 定位。

为了实现上述目的，提供一种线粒体靶向的基因编辑系统，其中包括：

a.线粒体靶向的DNA核酸酶，

b.线粒体靶向的sgRNA，

c.线粒体靶向的RNA修复模板。

所述的DNA核酸酶为SpCas9、SaCas9、CPF1、ZFN、TALENs。

线粒体靶向的DNA核酸酶的构建方法为：设计编码COX8基因线粒体定位 序列的互补寡核苷酸链，退火后连入SpCas9的表达载体，得到COX8 MTS-SpCas9融合蛋白，启动子为CBh。

线粒体靶向的sgRNA构建的sgRNA的方法为：设计包含线粒体定位的RNA 信号与针对人源ND4基因的sgRNA的互补寡核苷酸链，退火后连入sgRNA的 表达载体，得到mitoRNAsignal-ND4sgRNA融合序列，启动子为U6。

线粒体靶向的RNA修复模板的制作方法为：采用DNA合成的方式，将线 粒体定位的RNA信号与带有HA标签序列的人源ND4修复模板融合得到 mitoRNAsignal-ND4-HA序列，酶切连接进入U6表达载体

一种线粒体靶向的基因编辑方法，采用上述任一基因编辑系统，将线粒体 靶向的DNA核酸酶、线粒体靶向的sgRNA和线粒体靶向的RNA模板定位至线 粒体中。

采用Lipofectamine3000转染试剂将线粒体定位的DNA核酸酶、线粒体定 位的sgRNA和RNA修复模板的表达载体共转染入293细胞系，37度二氧化碳 培养箱培养48小时。提取细胞基因组DNA，采用HA特异性的正向引物和人源 ND4特异性的反向引物进行PCR。

本发明利用序列特异性的核酸酶在靶位点处或附近制造一个DNA双链缺口 (DSBs)，通过RNA模板实现靶位点处的同源重组修复。

[附图说明]