[发明专利]动物粪便宏基因组来源的低温邻苯二酚1;2-双加氧酶、其编码基因及其制备方法

说明书

本发明公开了一种动物粪便宏基因组来源的低温邻苯二酚1,2‑双加氧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，共309个氨基酸，理论分子量为33.72kDa；其编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因大小为930bp。该低温邻苯二酚1,2‑双加氧酶最适作用pH为8.0，在pH 7.0～9.0范围内处理1h后，酶活剩余60％以上；最适作用温度为25℃，在0℃和10℃分别具有约30％和60％的酶活；25℃和37℃下耐受1h对酶活无影响，25℃条件下耐受26h仍保持65％以上的酶活，可用于顺,顺‑己二烯二酸的酶法合成以及低温环境中芳香族化合物的降解。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种动物粪便宏基因组来源的低温邻苯二酚1，2-双加氧酶、其编码基因及其制备方法。

背景技术

芳香族化合物是地球上仅次于碳水化合物的第二大类有机碳源，在自然界中广泛存在。邻苯二酚是微生物代谢酚类和大多数多环芳香族化合物的中间产物，邻苯二酚的进一步裂解对多环芳烃是否能彻底降解起着重要作用。邻苯二酚1,2-双加氧酶(EC1.13.11.1)是催化邻苯二酚邻位氧化开环的关键芳环加氧酶，该酶催化邻苯二酚裂解形成中间物——顺,顺-己二烯二酸，并在后续酶促反应中进一步被降解进入三羧酸循环，因此邻苯二酚1,2-双加氧酶在微生物降解多种芳香族化合物的过程中有着重要作用。此外，该酶催化邻苯二酚裂解形成的中间产物顺,顺-己二烯二酸是一种精细化工原料，可用于生产特殊性能的工程塑料、树脂、尼龙等，以及合成抗菌素、抗阻胺剂、乳化剂等。

因此，近年来Acinetobacter[Lin et al.Protein J,2015,34(6):421-433]、Arthrobacter[Eck et al.Gen,1993,123(1):87-92]、Corynebacterium[Shen etal.Biotechnol Lett,2004,26(7):575-580]、Pseudomonas[Kim et al.J BasicMicrobiol,2015,55(3):354-362；Kaneko et al.Chem Lett,2011,40:381-383]、Rhodocococcus[Strachan et al.Biochem J,1998,333:741-747,Murakami et al.Gene,1997,185(1):49-54]和Streptomyces[An et al.FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):17-22]等多种细菌的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因相继被克隆、表达并鉴定。低温邻苯二酚1,2-双加氧酶在低温环境中具有较高的酶活，可用于低温环境中芳香族化合物的降解，相对于中温或高温邻苯二酚1,2-双加氧酶有其特有的应用优势。此外，将中温或者高温条件下顺,顺-己二烯二酸的生产过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用。然而，目前利用常规微生物培养法从上述细菌克隆得到的邻苯二酚1,2-双加氧酶最适作用温度一般为30～40℃，仅Pseudomonas sp.PAMC 25931来源的邻苯二酚1,2-双加氧酶的最适作用温度为25℃，但是该酶温度稳定性较差，37℃下耐受1h酶活完全丧失，25℃下耐受1h酶活损失35％[Kim et al.J Basic Microbiol,2015,55(3):354-362]。

动物尤其是植食性动物由于广泛摄食各种植物，其胃肠道是木质素及其相关酚类物质降解的环境，同时通过环境互作对环境污染物的代谢，使得在长期进化过程中通过适应和自然选择，其胃肠道中可能存在参与芳香族化合物代谢的功能基因。然而，传统的微生物纯培养技术使得占微生物种类99％以上的不可培养微生物无法分离获得，因此通过分离培养微生物来筛选新型酶的传统方法大大限制了筛选的广泛性和有效性。宏基因组学避开了微生物分离培养的问题，极大地扩展了微生物资源的利用空间，为寻找和发现新的功能基因及生物催化剂——酶提供了新的研究策略。