[发明专利]一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重要作物病毒的人工接种方法及其应用，尤其是一种简单快速接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用。

背景技术

中国小麦花叶病毒(Chinesewheatmosaicvirus，CWMV)是我国上世纪末在山东发现的一种土传病毒，现已划入帚状病毒科(familyVirgaviridae)菌传杆状病毒属(genusFurovirus)。CWMV在小麦病株上引起典型的症状包括：幼叶呈现褪绿条纹，老叶则黄化甚至变成紫色。严重的病株矮缩、萎蔫甚至死亡，从而导致产量损失严重。分子鉴定显示棒状的CWMV粒子内部含有2条单链正义RNA(ssRNA)基因组片段，分别称为RNA1和RNA2。基因组测序分析表明RNA1长7147nt，编码3个病毒运动和复制所必需的蛋白；而RNA2则较短，仅3564nt，编码4个蛋白，其中3个与病毒外壳蛋白有关，另一个则是富含半胱氨酸的RNA沉默抑制子。在自然条件下，中国小麦花叶病毒，由土壤专性寄生的禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)传播，该类病毒在真菌介体的休眠孢子中存活数载，这给该类病害的防控带来了严重困难。由于其介体禾谷多黏菌高度专性寄生，十分难以人工体外培养；在自然条件下，禾谷多黏菌种群复杂多样，加之土壤中微生物群落复杂多样，也难以获得高效传播CWMV的禾谷多黏菌纯系，因此，CWMV自然条件下的介体传播接种模式至今仍然无法在实验室条件下进行，这给CWMV及相关病毒的深入研究和生物学特性分析带来了困扰；另一方面，CWMV虽然能够摩擦接种，但其效率有限，也难以在抗病筛选和CWMV深入研究中发挥作用。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种简单快速高效的接种中国小麦花叶病毒的方法及其应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种快速高效的接种中国小麦花叶病毒的方法，包括以下步骤：

1)引物设计：通过本实验室测定的中国小麦花叶病毒基因组片段RNA1和RNA2序列共设计4条引物，引物序列见表1，其中引物对R1f/R1r用于扩增RNA1,引物对R2f/R2r用于扩增RNA2；

2)病毒基因组扩增反应：以病毒基因组cDNA作模板，采用高保真的DNA聚合酶(NEB)进行扩增，其中引物对R1f/R1r扩增的RNA1产物长约7.2-kb，引物对R2f/R2r扩增的RNA2产物长约3.6-kb；

3)病毒基因组克隆：病毒全长基因组RNA1、RNA2扩增产物经切胶纯化后，采用In-Fusion克隆试剂盒(Clontech)参照商家说明书分别连接至线性化的双元载体质粒上，测序验证获得分别含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组双元载体质粒，然后利用电转化仪将含RNA1和RNA2全长cDNA片段的重组质粒分别导入农杆菌；

4)人工接种：将含有CWMV基因组的农杆菌等量混合，然后通过注射器将农杆菌混合液浸润入植物体内，2周后进行病毒分子检测并观测植株表型变化；

一种快速高效的接种中国小麦花叶病毒的方法的应用，包括以下步骤：

病毒温敏性分析：经人工接种CWMV的植株，分别置于12、15、17、20、25℃条件下继续培养，二周后进行病毒分子检测并分析病毒在不同温度下的复制等特性。

表1本发明所设计的引物