[发明专利]一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法

权利要求书

1.一种裸鼹鼠心肌细胞的培养方法，包括以下步骤：

(A)向裸鼹鼠心肌组织中加入胰蛋白酶进行消化1-2次，弃去上清液；所述的胰蛋白酶浓度为0.08％(w/v)，采用0.25％(w/v)胰蛋白酶和D-hank’s溶液按照体积比1:2混合均匀配制而成；

(B)在步骤(A)中所得的细胞沉淀中，加入混合消化液，轻轻吹打心肌组织悬液进行消化后，静置；所述的混合消化液为0.125％(w/v)胰蛋白酶和0.3％(w/v)Ⅱ型胶原酶按照体积比2:1混合均匀配制而成，混合消化液中胰蛋白酶终浓度为0.08％(w/v)，Ⅱ型胶原酶终浓度为0.1％(w/v)；

(C)收集步骤(B)中的上清液，用200目细胞筛过滤后，立即加入等量终止液终止消化，并于冷冻离心机中4℃、1000rpm、离心5min；

(D)步骤(C)中所得的细胞沉淀，依次重复操作步骤B、步骤C，重复消化次数为6～10次；

(E)收集所有细胞于同一离心管中，用终止液重悬细胞，并于冷冻离心机中4℃、1000rpm、离心5min，弃去上清液，于细胞沉淀中加入终止液重悬细胞，再次于冷冻离心机中4℃、1000rpm、离心5min，弃去上清液，于细胞沉淀中加入终止液重悬、混匀细胞；

(F)将步骤(E)中所得细胞悬液接种于培养容器中，置于培养箱内培养，通过差速贴壁法分离心脏成纤维细胞与心肌细胞；

(G)收集步骤(F)中未贴壁的心肌细胞悬液，于冷冻离心机中4℃、1000rpm、离心5min，所得细胞沉淀用培养基混悬后，置于培养箱内培养；

所述的步骤(F)和步骤(G)中培养箱的环境温度为35℃，O₂体积浓度为5％、CO₂体积浓度为5％。

2.根据权利要求1所述的裸鼹鼠心肌细胞的培养方法，其特征在于，所述的步骤(A)和步骤(B)中每次消化时间为5～10min，消化的温度为35～37℃。

3.根据权利要求1所述的裸鼹鼠心肌细胞的培养方法，其特征在于，所述的步骤(C)和步骤(E)中终止液为含8～12％(v/v)胎牛血清的DMEM培养基。

4.根据权利要求1所述的裸鼹鼠心肌细胞的培养方法，其特征在于，所述的步骤(F)中差速贴壁法细胞培养时间为60～90min。

5.根据权利要求1所述的裸鼹鼠心肌细胞的培养方法，其特征在于，所述的步骤(G)中的培养基为含8～12％(v/v)FBS、1％(v/v)青、链霉素双抗抗菌液、0.1mmol/L 5-Brdu的DMEM低糖培养基。