[发明专利]光检测装置

说明书

技术领域

本发明涉及在油中将样品分割为大量的液滴之后进行分析的光检测装置。

背景技术

近年来，在油中将样品溶液分割为体积从皮升至纳升等级的液滴1万个～1千万个，在各液滴的内部发生基于样品成分的反应，检测各液滴的反应结果，由此来高精度、高灵敏度地进行样品的分析的液滴数字分析法备受瞩目。分析对象有核酸、蛋白质等各种各样，但控制成绝大多数的液滴中含有0个或1个分析对象，由此具有得到源自单一分析对象的反应结果，或者能够定量样品中所含的分析对象的绝对个数的优点。通过控制成例如各液滴中含有0个或1个构成样品的细胞，能够定量源自单一细胞的特定抗原量的平均值和方差，或者能够定量源自单一细胞的基因突变的比例。其中，应用于PCR的液滴数字PCR(以下称为ddPCR(droplet digital PCR))已经显着发展，并且预期不仅被应用于研究领域，而且被应用于诊断领域。

作为现有的定量PCR的主要方法的实时PCR，通过逐次测量每个热循环的扩增反应的进行度来定量样品中原本存在的分析对象基因。但是，为了实施该方法，需要事先测量分析对象基因的各个稀释系列的相对于热循环次数扩增反应的进行度，将其用作校准曲线。但是，在样品中的分析对象基因的扩增效率与取得校准曲线时的扩增效率不同的情况下，会发生定量结果与事实不同的情况。与之相对地，ddPCR由于数字计数样品中原本存在的分析对象基因来定量，所以不需要校准曲线，不容易受到分析对象基因的扩增效率的变化所致的影响，因此是简便且高精度的定量PCR。例如在从试样提取基因组后，按每个PCR试剂将其分割成大量的液滴，并进行数字化的PCR扩增反应。使用根据有无突变而发出荧光的TaqMan探针等，测量单个液滴的荧光并对阈值以上的荧光进行数字计数。通过采用大量的液滴能够以比较低的成本看到低频度的基因突变，这方面非常优秀。

当前，作为ddPCR装置，产品化的有Bio-Rad公司的QX200、RainDance Technologies公司的RainDrop等。各种ddPCR装置都是同样的机制。Bio-Rad公司的ddPCR装置的机制如非专利文献1的图1所示。首先，将含有PCR试剂的样品20微升和油放入设置于ddPCR装置的树脂制的液滴形成盒中，利用负压吸引和流动聚焦喷嘴机构在油中形成1纳升体积的液滴2万个左右。各液滴通过添加表面活性剂而在油中稳定化。接着，将油中的大量的液滴用移液管移动到现有的微量滴定板上的一个孔中，并使用现有的热循环仪执行PCR直到滴定终点(end point)。接着，再次在ddPCR装置中，一边负压吸引油中的大量的液滴一边使之在形成于树脂制的微芯片内的通道中排成一排而流动，进而在通道中追加油由此扩大液滴间隔使之流动，通过对通道照射激光光束来依次照射各个液滴，依次测量来自各个液滴的发光荧光。在此，在PCR前包含分析对象基因的液滴在PCR后受到扩增而发出强的荧光，与之相对地，在PCR前不包含分析对象基因的液滴在PCR后不受到扩增而仅发出弱的荧光。即，通过对荧光强度设定适当的阈值，对具有超过阈值的荧光强度的液滴的个数、具有低于阈值的荧光强度的液滴的个数分别进行数字计数，高精度地定量样品中所含的分析对象基因的绝对量。

另一方面，在ddPCR中，使用矿物油，硅油，氟油等各种油，但通常由于油和液滴的折射率不同，所以当对液滴照射激光束时，会在界面处发生散射。专利文献1中提案有，为了避免或减少这种液滴界面处的散射，使油和液滴的折射率一致或接近。由此，能够以高灵敏度检测源自存在于液滴内部的细胞的散射光。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2015/015199A2

非专利文献

非专利文献1：Anal.Chem.2011，83，8604-8610

发明内容

发明要解决的课题