[发明专利]用于细胞转染和蛋白生产的新型选择性标记物

说明书

本发明属于工业蛋白生产领域。本发明提供使用二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)作为选择性标记物与来氟米特或其代谢物组合的新型表达系统，其尤其可用于在哺乳动物细胞系中使用。还提供编码DHODH的表达载体、包含所述载体的细胞系和生产重组蛋白的方法。

发明领域

本发明属于工业蛋白生产领域。本发明提供使用二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)作为选择性标记物与DHODH抑制剂(特别是特立氟胺)组合的新型表达系统，其尤其可用于在哺乳动物细胞系中使用。还提供编码DHODH的表达载体、包含所述载体的细胞系和生产重组蛋白的方法。

发明背景

以工业规模生产重组蛋白需要分离产生大量重组蛋白的克隆。将异源基因引入动物宿主细胞并对所添加的基因的表达进行筛选是长期和复杂的过程。该过程涉及转染和对具有稳定的长期表达的克隆进行选择，和对对于相应的重组蛋白具有高表达率的克隆进行筛选。

当生成从表达载体表达重组蛋白的克隆时，经常使用在相同载体上编码感兴趣的蛋白和选择性标记物二者的DNA载体转染宿主细胞。这样的表达载体因此包含允许对其中存在表达载体的克隆进行选择的可选择标记物。这样的可选择标记物还可导致转染的DNA的共扩增，由此允许高生产克隆的分离。

大多数可选择标记物为对抗生素或其他毒性物质赋予抗性的蛋白或对细胞生存至关重要的蛋白。本领域已知数种这样的可选择标记物，包括例如G418、潮霉素、嘌呤霉素、博莱霉素、二氢叶酸还原酶(DHFR)、谷氨酰胺合成酶(GS)和次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)。具体而言，GS在真核细胞中的工业重组蛋白生产领域中广泛用作可选择标记物。GS基因允许对于细胞生长至关重要的谷氨酰胺的合成，且受到MSX(L-甲硫氨酸亚磺酰亚胺)的抑制。在MSX存在下，仅表达大量GS的细胞将存活。适当筛选后，可能选择生产外源蛋白的细胞。

当生产重组蛋白时，开发其他允许对大量表达重组蛋白的克隆(至少其中一些以高水平表达蛋白)进行分离的表达系统将扩展可用的选择，并增加鉴定适于在大规模蛋白生产中使用的高表达克隆的可能性。

发明概述

本发明的发明人基于将二氢乳清酸脱氢酶(DHODH)用作可选择的标记物开发了新的表达系统。DHODH是嘧啶合成所需的酶。抑制DHODH的化合物因此抑制DNA合成且进而抑制细胞增殖。基于化合物的毒性可由其靶标的过表达缓解的原理，发明人推测在细胞中过表达野生型DHODH可赋予对DHODH抑制剂的抗性。其建立了编码DHODH的抗体表达载体用于与DHODH抑制剂组合使用，所述DHODH抑制剂包括来氟米特(IUPAC名称:5-甲基-N-[4-(三氟甲基)苯基]-异噁唑-4-甲酰胺)和特立氟胺(IUPAC名称:(2Z)-2-氰基-3-羟基-N-[4-(三氟甲基)苯基]丁-2-烯酰胺)。其惊人地发现了当DHODH抑制剂是特立氟胺时分离生产抗体的克隆更加有效。其显示了在使用特立氟胺培养的CHO(代表中国仓鼠卵巢)细胞中使用包含所述载体的表达系统使得能够以与标准GS标记物相当水平分离产生抗体的克隆。

在细胞培养中生产重组蛋白的背景下，这是首次将DHODH用作可选择标记物。

US2003/0166201描述了抗抑制剂或不由选择剂抑制的改变的DHODH作为可选择标记物的用途。然而，US2003/0166201未描述将DHODH作为用于生产重组蛋白的标记物。此外，US2003/0166201未公开野生型DHODH或由选择剂抑制的改变的DHODH的用途，其局限于不受选择剂抑制的DHODH的用途。