[发明专利]对TRACP-5b（酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b）具有特异性的蛋白定量法

说明书

本发明旨在提供对于特异性测定酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b有用的单克隆抗体。以从蚕绢丝腺纯化的人重组酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b(TRACP‑5b)作为抗原，由细胞融合，得到了产生有对TRACP‑5b的反应性高于对酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5a(TRACP‑5a)的反应性的特异性的针对TRACP‑5b的单克隆抗体的杂交瘤。通过使用此单克隆抗体，可高灵敏度并且特异性检测待测样品中的TRACP‑5b。

【技术领域】

本发明涉及产生对于酒石酸抵抗性酸性磷酸酶5b(TRACP-5b：别名、破骨细胞来源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶)特异性的单克隆抗体、该单克隆抗体的杂交瘤、使用该单克隆抗体的TRACP-5b的检测方法、以及在其中使用的试剂盒。

本发明的单克隆抗体作为骨吸收的标志物，在骨疾病的医学治疗或临床检查的领域中极有效。

【背景技术】

血清中的酒石酸抵抗性酸性磷酸酶(TRACP：Tartrate Resistant acidPhosphatase EC3.1.3.2)其大部分是破骨细胞来源的酸性磷酸酶，其测定作为评价破骨细胞的功能的指标有用，作为骨吸收标志物被感兴趣(非专利文献1)。一方面，血清中的酸性磷酸酶由聚丙烯酰胺凝胶电泳，从原点起分为0～5的6个条带，在其中，第5是酒石酸抵抗性，从而被称为Band5酒石酸抵抗性酸性磷酸酶(TRACP5)。这还由电泳分为与糖链的唾液酸键合多的5a和几乎无唾液酸键合的5b。进而，5a是来自血小板或其他的酶而血中值不变动，与此相对，由于仅5b伴随骨吸收而变动，5b被认为是破骨细胞来源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶的本体(专利文献1)。

再者，Clinical在Chemistry志(非专利文献2)中也提议将破骨细胞来源的ACP简写为TRACP-5b。从而，在本说明书中也将破骨细胞来源、且表示成为骨吸收的指标的ACP表示为TRACP-5b，破骨细胞来源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶和酒石酸抵抗性酸性磷酸酶 5b作为同义表示为TRACP-5b。

作为表示破骨细胞的活性的酸性磷酸酶的指标求出TRACP活性的以往的活性测定法在特异性、灵敏度、测定的复杂性及测定时间的方面有问题。

一般而言，由活性测定法的TRACP-5b的测定通过在酒石酸的存在下作为合成底物使用磷酸酯而对由酶反应发生的反应生成物(醇或苯酚类)进行比色定量求出酶活性。此时，酒石酸抑制前列腺来源酸性磷酸酶，通过将残留的酸性磷酸酶活性用底物测定，将TRACP活性看作TRACP-5b活性而求出。但是，由于也测定了在待测样品中存在的破骨细胞来源以外的红细胞来源或血小板来源的酒石酸抵抗性酸性磷酸酶，在特异性的方面有问题。作为上述方法的改善法，将血清稀释5倍的液于37℃温育1小时的预处理之后，已知将其余的TRACP 活性在酒石酸存在下、作为底物使用p-硝基苯基磷酸(pNPP)而测定的方法(非专利文献3及非专利文献4)。此方法可回避红细胞来源酸性磷酸酶的影响，但无法排除血小板来源酸性磷酸酶的影响。再者，作为更特异性的活性测定法，本发明人报告了利用TRACP-5b和红细胞或血小板来源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶活性对于氟的感受性有差异的TRACP-5b测定法(专利文献2)。但是，尽管无红细胞及血小板来源酒石酸抵抗性酸性磷酸酶的影响，但无法排除TRACP-5a的影响，另外，通过从总酒石酸抵抗性酸性磷酸酶活性减去在氟存在下不被抑制的活性而求出TRACP-5b活性，在精度的方面要求进一步的改良。再者，报告有通过在上述利用氟的方法中组合TRACP-5a的抑制物质而使用，更特异性地测定TRACP-5b活性的方法(专利文献3)。但是，尽管比仅使用氟的方法更有特异性，但由于仍然由减法求出破骨细胞来源TRACP-5b活性，同样地在精度的方面留有问题。