[发明专利]烷基化流感疫苗

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年8月18日提交的美国临时申请62/038,753的优先权，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。

背景

流行性和大流行性流感每年发生，并且是全世界显著发病率和死亡率的原因。流感病毒是由两种表面糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)组成的高度多形性颗粒。HA在病毒穿透进入细胞期间介导病毒对宿主细胞的附着和病毒-细胞膜融合。因此，流感疫苗通常含有有效量的与疾病株匹配的HA，以诱导针对该疾病株的中和抗体的产生。

已使用单辐射免疫扩散(Single-radial-immunodiffusion)(SRID)测定来测定流感疫苗中的血凝素(HA)含量，以及测量自1978年以来由食品药品监督管理局许可用于美国的流感病毒疫苗的效力。具体而言，SRID通过使用特异性抗HA抗体来测定流感疫苗中的HA含量。将疫苗样品施加至含有毒株特异性抗血清的琼脂平板上。通常将板在室温下于保湿室中孵育以允许抗原扩散。抗原与抗体的反应产生沉淀区(其呈沉淀环的形式)。可通过将样品的环直径与已知浓度的参照HA蛋白的直径进行比较来定量疫苗样品中的HA的量。所测试的疫苗的效力值可基于HA的量来获得。

概述

本发明除其它以外提供了具有保留在储存时通过SRID测量的效力的显著能力的改进的流感疫苗。本发明部分基于以下令人惊讶的发现：将HA抗原暴露于烷化剂(例如，2-碘乙酰胺(IOAM))导致在储存后通过SRID测量的HA效力的显著减少的损失。例如，如实施例部分所述，本发明人已证明，一些IOAM处理的HA抗原在储存6个月后显示如通过SRID测定的仅约1-5％的效力损失。不希望受任何特定理论束缚，预期HA效力随时间的损失的可能机制是分子间半胱氨酸键的形成。这些共价键在两性去垢剂(zwittergent)预处理时阻止HA玫瑰花结宏观结构解离，从而限制通过凝胶基质的迁移，导致与抗血清的相互作用减少。用烷化剂处理导致HA抗原的反应性半胱氨酸基团的烷基化，这阻止分子间二硫键形成。因此，本发明提供的烷基化HA抗原可在储存后更好地保持通过SRID测量的效力。由于SRID是用于测定流感疫苗中HA效力的最常用的测量方法之一并且是FDA和其它主要卫生局目前接受的唯一测定法，因此本发明允许确保在疫苗的寿命期间保留所需效力的疫苗的生产。

在一个方面，本发明提供了包含含有一个或多个烷基化半胱氨酸残基的血凝素的流感疫苗。在一些实施方案中，血凝素含有1-5、1-4、1-3、2-5、2-4、2-3、3-5、3-4或4-5个烷基化半胱氨酸残基。在一些实施方案中，血凝素含有1、2、3、4或5个烷基化半胱氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个烷基化半胱氨酸残基构成血凝素中存在的总半胱氨酸残基的约1-50％、1-40％、1-30％、1-20％或1-10％。在一些实施方案中，所述一个或多个烷基化半胱氨酸残基构成血凝素中存在的总半胱氨酸残基的约10％、20％、30％、40％或50％。在一些实施方案中，基本上所有游离半胱氨酸残基被烷基化。在一些实施方案中，烷基化半胱氨酸残基包含甲基化半胱氨酸残基。在一些实施方案中，血凝素不具有非特异性的烷基化和/或遍在的甲基化。在一些实施方案中，通过质谱法测定烷基化半胱氧酸残基。

在另一方面，本发明提供了包含用烷化剂处理的血凝素的流感疫苗。如本文所用，适用于本发明的烷化剂可以是能够烷基化半胱氨酸巯基的任何化合物。在一些实施方案中，烷化剂选自由以下组成的组：2-碘乙酰胺(IOAM)、碘乙酸、2-溴乙酰胺、谷胱甘肽溴乙酰胺、溴乙酸、1，3-丙磺酸内酯、甲基硫代磺酸甲酯(methyl methanethiosulfonate)、甲氧基羰基甲基二硫化物、马来酰胺、马来酰亚胺-PEG、乙烯基吡啶、N-乙基马来酰亚胺、甲苯磺酰基乙酰胺及其组合。在一些实施方案中，烷化剂是2-碘乙酰胺(IOAM)。

在各种实施方案中，适用于本发明的血凝素是存在于加利福尼亚或所罗门毒株中的H1蛋白，存在于布里斯班、佛罗里达、俄亥俄、江苏或香港毒株中的B蛋白，和/或存在于维多利亚、珀斯、布里斯班或威斯康星毒株中的H3蛋白。