[发明专利]无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质纯化领域，特别涉及无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法。

背景技术

蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质，易受外界条件的影响发生变性，有的甚至难以复性。蛋白质稳定性除与蛋白组成中的氨基酸残基种类有关系外，还与去杂、纯化采用的方法有极大的关联，处置不当可能产生蛋白一级结构断裂、高级结构变性和高级级结构裹挟杂质等问题。

CNB是钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin,CN)B亚基。CN是目前所知唯一一种依赖Ca2+/CaM的蛋白磷酸酶，于上世纪70年代末、80年代初由加籍华人王学荆、美籍华人张槐耀及美国的ClaudeB.Klee分别发现并从牛脑中提纯。该酶由A、B二亚基以1:1的比例组成。A亚基(CNA)是催化亚基，相对分子质量61×10³；B亚基(CNB)是调节亚基，相对分子质量19×10³。CNB的稳定性较好些，起初曾采用100℃高温去除杂质也能得到纯化物，但由于目标蛋白CNB中含有如谷氨酰胺和天冬酰胺等氨基酸残基易发生水解作用，100℃高温对蛋白的破坏是显而易见的，并且由于高温的作用可能使得有些较大的杂蛋白变成了较小的杂蛋白与目标蛋白混杂裹挟，难以离心去除，妨碍后续纯化。

因此，提供一种去除rhCNB工程菌破碎液中杂蛋白的方法及絮凝剂具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种无机氯化物的应用、杂蛋白絮凝组合物及杂蛋白絮凝方法。本发明在研究rhCNB项目的过程中，发现在适当的加入电解质产生杂蛋白絮凝作用后，较低的保温措施使得杂蛋白颗粒增大的方法，使杂质易于离心去除，保护了目标蛋白，方法经济、高效、可靠、稳定，极大促进和优化了rhCNB的蛋白纯化。杂质清除率≥90％。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了无机氯化物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述应用中所述无机氯化物为氯化钠和/或氯化钙。

本发明还提供了一种杂蛋白絮凝组合物，包括无机氯化物。

在本发明的一些具体实施方案中，所述杂蛋白絮凝组合物中所述无机氯化物为氯化钠和/或氯化钙。

在本发明的一些具体实施方案中，所述杂蛋白絮凝组合物中所述氯化钠与所述RhCNB工程菌破碎液的质量比为(3～5)：100。

在本发明的一些具体实施方案中，所述杂蛋白絮凝组合物中所述氯化钙所述RhCNB工程菌破碎液的质量比为(0.03～0.05)：100。

本发明还提供了所述杂蛋白絮凝组合物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。

本发明提供了一种去除rhCNB工程菌破碎液中杂蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤1：制备获得rhCNB工程菌破碎液；

步骤2：取所述rhCNB工程菌破碎液与如权利要求3至6任一项所述的杂蛋白絮凝组合物混合，絮凝，离心分离，收集上清液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述絮凝的温度为38～58℃。

在本发明的一些具体实施方案中，所述絮凝的时间≤45min。

本发明中，rhCNB工程菌破碎液的制备方法为：取在-70℃冻存的工程菌(基因工程药物与生物技术北京市重点实验室提供原始工程菌，海口奇力制药股份有限公司制备工作种子(生产或制备用rhCNB工程菌)，用LB培养基(每升含蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠5g、1mol/L氢氧化钠溶液1ml)氨苄青霉素50mg,按每升培养基接种1ml的接种量接种，37℃扩增培养8-18小时，作为一级种子液，再用新配制的LB培养基接种发酵培养10-20小时收取菌体。取菌体，用含有50mmol/L的Tris、1.2mmol/L的依地酸二钠和40mmol/L氯化氢的缓冲溶液pH值为7.4配制成含10：90菌体的菌悬液，用高压匀质机破碎，即得；破碎率达95％以上。

本发明提供了无机氯化物在rhCNB工程菌破碎液杂蛋白絮凝中的应用。本发明在研究rhCNB项目的过程中，发现在适当的加入电解质产生杂蛋白絮凝作用后，较低的保温措施使得杂蛋白颗粒增大的方法，使杂质易于离心去除，保护了目标蛋白，方法经济、高效、可靠、稳定，极大促进和优化了rhCNB的蛋白纯化。