[发明专利]大斯托克斯位移荧光蛋白CyOFP及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物医学光学与分子影像学技术领域，具体涉及一种大斯托克斯位移荧光蛋白CyOFP及其应用。

背景技术

在生物医学光学与分子影像学领域中，荧光蛋白在研究活体细胞内基因的表达水平、蛋白相互作用、蛋白质构象以及蛋白活性中有着重要的应用。但是，在使用荧光蛋白进行活体成像时，往往难以实现多通道同时成像，若能突破这一限制，则可实现对多个生物快速反应事件的检测，将极大推动神经科学的发展。在单光子成像中，可采用由不同激发波长的光激发多种荧光蛋白来实现多通道同时成像。然而，在多光子成像中，添加一个二级钛蓝宝石雷射或光学参数振荡器的费用较高，并且难以将它们调控到一起，因此，多种荧光蛋白同时成像较难实现。开发出大斯托克斯位移的荧光蛋白可有效的解决这一问题，实现同一激发波长的光同时激发两种荧光蛋白，然后发射出不同波长区域的光，达到两种荧光蛋白多光子同时成像的目的。该方法具有操作简单、对设备要求不高、成像效果好等优点。

目前同时成像多个生物分子事件的显微镜方法包括，探测薄样品的超分辨结构光照明，散射组织中提升分辨率的自适应光学，提高成像速度的随机扫描双光子技术，以及可以降低光毒性与光漂白同时又能提高成像速度的光片式照明，它可以通过贝塞尔光束或光学晶格、非相干聚焦等方式实现。这些显微镜方法均依赖于对激光的动态调制，因此，如果想做多色的(双波长，多波长)荧光成像就要求多套重复的光学器件，以及更加精确的同步控制，这造成了一些技术难关。如能开发出一种大斯托克斯位移的荧光蛋白，并能和常用的绿色荧光蛋白结合在一起使用，将使两种不同的生物反应事件可视化，大大降低对光学器件的高要求。

生物发光由于其不需要光激发、背景低特点，已成为活体光学成像的重要手段之一。然而较亮的荧光素酶(通过与底物的生化反应而产生光子)不仅量子产率低，而且发射光子的波长较短(激发峰<600nm)，因此限制其在动物体内的应用。基于荧光素酶和荧光蛋白的生物发光共振能量转移(BRET)则很好的解决了上述问题。然而，目前基于BRET的生物发光探针中的红色荧光蛋白的量子产率相对较低(<0.4)，而且荧光素酶的发射光谱与荧光蛋白的吸收谱重叠较少，因此BRET效率较低。因此，需要能够与现有最亮的荧光素酶(Nluc，发射峰在460nm)在光谱上有高重叠的荧光蛋白，而且其发射峰在600nm处。

斯托克斯位移指的是荧光物质的最大发射波长和最大激发波长之差。该差值若大于100nm，则认为该荧光蛋白具有大斯托克斯位移的特性。大斯托克斯位移的荧光蛋白在多色双光子成像时，可保证两个不同光谱的荧光蛋白可被同时荧光成像，并且有效地减少荧光光谱的串扰。此外，它(受体)可以与荧光素酶(供体)一起在生物体内进行非辐射的能量转移，也就是生物发光共振能量转移(BRET)。由于BRET不需外源光激发且背景低，因此生物发光成像灵敏度非常高，已经在蛋白相互作用、活体影像、核酸分析、蛋白酶检测及高通量筛选等生物分析相关领域得到了广泛的应用。