[发明专利]一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法

权利要求书

1.一种氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：步骤如下：

⑴利用主产物氢化可的松、副产物表氢化可的松、底物17-羟基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯遇浓硫酸反应显不同颜色的特性，使用乙酸乙酯将发酵液中成分萃取出来，加入浓硫酸，使其与硫酸发生反应，导致颜色发生相应变化；

⑵先对HC/浓硫酸、EHC/浓硫酸、RSA/浓硫酸进行全波长扫描，得到HC/浓硫酸、RSA/浓硫酸的最大吸收峰值分别为474nm、535nm；

⑶根据朗伯比尔定律结合三维数据建模二阶校正得出氢化可的松转化率的计算公式；通过singmapolt软件拟合成三维立体平面图；

⑷通过测定发酵液中的成分与浓硫酸反应在可见光双波长下的OD值，即可计算出待测发酵液中氢化可的松的转化率。

2.根据权利要求1所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：具体步骤如下：

⑴待测菌种发酵产生的发酵液pH降至3.8以下后，调节pH为6.5,投入0.25％的RSA，继续培养至72h；

⑵将步骤⑴得到的发酵液中加入等量的乙酸乙酯，充分萃取后取6μL上层有机相置于96孔石英酶标板中；

⑶待步骤⑵中96孔石英酶标板中的乙酸乙酯挥发后，加入200μL浓硫酸，反应15min后使用酶标仪检测其在474nm处和535nm处的OD值；

⑷将氢化可的松、表氢化可的松、RSA、RS的标准品加无水乙醇溶解后，分别配置成浓度为0.5mg/mL的贮备液；

⑸将步骤⑷得到的HC、RSA、EHC，按照HC不同转化率，保持总质量为0.025mg，添加不同体积配比的RSA、HC、EHC标准品溶液于96孔石英酶标板中，待无水乙醇挥发后，加入200μL的浓硫酸，反应15min，分别在474nm、535nm波长处测定吸光度；

⑹将步骤⑸测得不同HC转化率对应474nm和535nm处的OD值整理，根据(A_474nm-A_535nm)/A_474nm计算出当X＝0.6时的数值K₀；再通过singmapolt软件拟合成三维立体平面图，并由此得出转化率X与A_474nm、A_535nm之间的函数关系；

⑺将步骤⑸中待测试样在474nm、535nm处的OD值代入公式K＝(A_474nm-A_535nm)/A_474nm，根据计算出的K值，将转化率在0-0.6之间的与0.6-1之间的分开，再步骤⑹得到的转化率X与A_474nm、A_535nm之间的函数关系，即可计算出待测发酵液中HC的转化率，进而快速检测出发酵液中HC的含量。

3.根据权利要求2所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：所述的步骤⑴中投料RSA要用80％的工业酒精助溶。

4.根据权利要求2所述的氢化可的松生物催化转化率的快速检测方法，其特征在于：所述的步骤⑵中发酵液和等量的乙酸乙酯要充分萃取，再室温下静置一段时间。