[发明专利]可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法

说明书

本发明涉及可溶性牙鲆NPY重组蛋白，具体的说是一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法。具体，构建NPY表达载体，表达载体重组表达，再经蛋白纯化、去内毒素、脱盐，而后于缓冲体系内，得可溶性的牙鲆重组NPY蛋白。本发明是大肠杆菌获得重组蛋白是可溶性的，避免了包涵体蛋白变性、复性过程，保证了蛋白的活性，优化了蛋白保存缓冲液，避免了纯化、去内毒素、脱盐后蛋白变性沉淀，维持了其可溶的状态，从而维持了其活性。

技术领域

本发明涉及可溶性牙鲆NPY重组蛋白，具体的说是一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法。

背景技术

神经肽Y一种内源性的促食欲因子，属于胰多肽家族，最早由Tatemoto从猪脑中提取的一种含有36氨基酸的单链多肽。NPY的结构与生物活性密切相关。NPY广泛分布在中枢及外周神经系统的神经元中，存在于器官、机体及腺体中，比如心脏、脑中等。大量研究表明NPY能够刺激动物摄食。通过脑室注射和腹腔注射NPY能够促进鱼类摄食。

牙鲆，俗称牙片，为鲆鲽鱼类，录属于鲽形目、牙鲆科、牙鲆属，是我国和日韩等国的重要海水养殖鱼类。提高养殖牙鲆生长速度是提高水产养殖业生产效率中的一个关键过程。

利用细菌进行重组表达蛋白是生物工程中常用方法，其培养简单，时间短，适合于工业化生产。

发明内容

本发明在于提供一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法。

为实现上述目的本发明采用的技术方案为：

一种可溶性牙鲆NPY重组蛋白获得方法，构建NPY表达载体，表达载体重组表达，再经蛋白纯化、去内毒素、脱盐，而后于缓冲体系内，得可溶性的牙鲆重组NPY蛋白。

所述构建NPY表达载体以牙鲆NPY cDNA序列为模板f-NPY-F和f-NPY-R为引物进而PCR扩增，产物插入pPROEX^TM HTa质粒的Nco I酶切位点并转化大肠杆菌BL-21(DE3)，即得到NPY表达载体；

所述引物f-NPY-F为5′-ATGCATCCTAACTTGGTGAG-3′；和f-NPY-R为5′-GCAGTGATGTGGATTCAACGTTGATTGC-3′。

将NPY表达载体蛋白于LB培养基中37℃下培养至A600达到0.8，而后经诱导剂诱导表达NPY重组蛋白。

所述NPY重组蛋白的菌体经过B-per(Thermo,US)处理、离心后获得的上清液；将收集的上清液用与其同体积的清洗缓冲液1稀释，得稀释的蛋白样品，稀释的蛋白样品过50％Ni-NTA纯化柱4℃孵育过夜，孵育后依次经清洗缓冲液1、清洗缓冲液2清洗纯化柱，而后经洗脱缓冲液洗脱，即得纯化蛋白；

其中，清洗缓冲液1为5mM NaH₂PO4，30mM NaCl，20mM咪唑；

清洗缓冲液2为5mM NaH₂PO4，30mM NaCl，50mM咪唑；

洗脱缓冲液为5mM NaH₂PO4，30mM NaCl，250mM咪唑。

所述将纯化后的蛋白溶液通过Ultra-15(Millipore，USA)离心柱浓缩脱盐(去咪唑)，将纯化后的蛋白溶液离心浓缩，而后浓缩液中加入含5mM NaH₂PO4，30mMNaCl的PBS缓冲液重悬，再经离心浓缩，直至除去咪唑得可溶性的重组牙鲆NPY蛋白。

本发明的优点：

本发明是大肠杆菌获得重组蛋白是可溶性的，避免了包涵体蛋白变性、复性过程，保证了蛋白的活性，优化了蛋白保存缓冲液，避免了纯化、去内毒素、脱盐后蛋白变性沉淀，维持了其可溶的状态，从而维持了其活性。

附图说明