[发明专利]改造核糖体结合位点提高基因工程菌株生产重组人骨形态发生蛋白2产量的方法

说明书

本发明涉及基因技术和微生物技术领域，涉及基因工程菌株生产蛋白质药物领域中的核糖体结合位点（RBS）改造技术。将大肠杆菌密码子优化后的重组人骨形态发生蛋白2（rhBMP‑2）基因（具有SEQ ID NO. 1核苷酸序列的DNA）克隆到质粒pET28a中得到质粒pHJBMP01；将pHJBMP01中RBS改变为新的RBS（具有SEQ ID NO. 2核苷酸序列的DNA）得到质粒pHJBMP02；将pHJBMP01和pHJBMP01分别导入大肠杆菌BL21得到sHJBMP01和sHJBMP02本发明提供的RBS改造后的sHJBMP02生产rhBMP‑2的发酵单位提高到136.3mg/L。

技术领域

本发明涉及基因技术和微生物技术领域，涉及基因工程菌株生产蛋白质药物领域中的核糖体结合位点(RBS)改造技术。

背景技术

骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein，BMP)是一类酸性糖蛋白，属转化生长因子超家族成员，这种蛋白质具有使未分化间充质定向分化为成骨细胞，并进而合成胶原、形成钙化骨组织能力。天然BMP能够诱导促进骨和软骨的形成，并可以与多种载体形成骨修复材料，广泛的应用于治疗新鲜骨折、骨缺损、骨不连、脊椎融合、股骨头坏死等骨科临床治疗。在已知的近20种BMP中，骨形态发生蛋白2(BMP-2)的诱导成骨活性最强，被研究和应用的最为广泛。但是天然BMP-2含量稀少、提取成本高昂，临床应用严重受限。

近年来的研究表明重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)具有较高的安全性和有效性，它由114个氨基酸残基组成，具有显著的成骨诱导能力，体外试验无细胞毒性，生物相容性良好，美国FDA于2002年7月批准rhBMP-2上市用于治疗脊椎融合。现在rhBMP-2已被应用于外科整形手术诱导骨再生，在骨组织工程及骨修复领域展现了巨大的潜在应用价值，成为临床骨科创伤疾病防治研究的热点。

本发明提供了改造核糖体结合位点(RBS)提高基因工程菌株生产rhBMP-2的产量的方法，以及1株RBS改造后的的基因工程菌株大肠杆菌sHJBMP02，该菌株生产rhBMP-2的产量比出发菌株提高了48％左右，达到136.3mg/L，遗传性状稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产。

发明内容

发明目的

提供了改造RBS提高基因工程菌株生产rhBMP-2的产量的方法，以及1株RBS改造后的基因工程菌株大肠杆菌sHJBMP02，该菌株生产rhBMP-2的产量比RBS改造前的出发菌株sHJBMP01提高了48％左右，遗传性状稳定，培养和发酵条件适合于工业化生产。

技术方案

大肠杆菌密码子优化后的rhBMP-2基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

新的RBS，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。

同时含有核苷酸序列为SEQ ID NO.1的DNA和含有核苷酸序列为SEQ ID NO.2的DNA的菌株sHJBMP02。

改造RBS构建基因工程菌株大肠杆菌sHJBMP02的方法，将具有SEQ ID NO.1序列的DNA克隆到质粒pET28a中得到质粒pHJBMP01；将pHJBMP01中的RBS改变为具有SEQ ID NO.2序列的DNA得到质粒pHJBMP02；将pHJBMP01和pHJBMP02分别导入大肠杆菌BL21得到2株基因工程菌株sHJBMP01和sHJBMP02，2个菌株均可以生产rhBMP-2。

本发明的有益效果：提供了1株RBS改造后的基因工程菌株sHJBMP02，该菌株生产rhBMP-2的产量稳定在136.3mg/L左右，比RBS改造前的出发菌株sHJBMP01提高了48％左右，该菌株生长速度快，遗传性状稳定，适合于在工业化生产rhBMP-2。

附图说明