[发明专利]基于基准点的相关显微术

说明书

技术领域

本发明涉及相关的显微术以及特别地涉及相关的光和电子显微术成像。

背景技术

生物样本中细胞结构的显微图像可以揭示关于生物过程和细胞架构的重要信息。使用光学显微术和电子显微术两者的相关方法产生最为综合性的结果。例如，光显微术信息可以用来识别样本内的生物重要性的区域和它们的动力学（dynamics）。然后电子显微术可以用来在固定和/或拉紧之后解析那些区域中的结构细节。

用常规光学显微镜收集的图像在分辨率方面被限制到所使用的光的波长的大约一半。对于实际的光学显微术，这个极限是200nm左右。因为这种限制，常规光学显微镜被说成是衍射受限的。许多技术为了提高分辨率超越衍射极限而存在。这样的技术被称为超分辨率技术。一个特定的技术是随机性光学重建显微术（STORM）。另一个技术是光激活定位显微术（PALM）。这些技术被用于使用可以在“开”状态和“关”状态之间切换的荧光标记来形成样本图像，在所述“开”状态中该标记发荧光，以及在所述“关”状态中该标记不发荧光。STORM典型地使用荧光有机染料，而PALM典型地使用荧光蛋白质。当标记在荧光发射之后进入黑暗状态并且然后在一段时间内对刺激不敏感时，实现状态之间的切换。由于这种未激活，绝大多数标记在给定的时间处于黑暗状态，其中仅有少数发射荧光。在形成样本的超分辨率图像方面，收集样本的较大系列的单独图像来独立于相邻标记定位每个个体标记。

在单独的图像中，每个标记表现为衍射受限点扩散函数。将高斯拟合应用到每个点扩散函数，以及标记位置现在由高斯拟合中心处的点来表示。通过对每个标记顺序成像并且应用这个过程，建立起样本的超分辨率图像，其允许成像越过衍射极限。可以使用例如被选择来基于不同标记的发射光谱来将它们的发射分离的二向色性光学器件来同时地成像不同颜色的荧光染料。使用若干波长通道可以允许同时对若干不同的细胞成分成像。

PALM的一个变化形式是干涉测量PALM，或“iPALM”。通过布置多个透镜，例如一个透镜在样本上方以及一个透镜在样本下方，所收集到的荧光可以引起与自身相干涉，以便产生干涉图案，其取决于两个透镜系统之间光路长度上的差异。这允许在Z维度上的定位。

非超分辨率技术（诸如共焦成像）也允许三维荧光成像（虽然具有降低的分辨率）。本发明还可以有利于也涉及这些类型的光学成像模态的相关显微术。

相关的显微术涉及用使用一种成像技术所创造的一个或多个图像覆盖利用另一种成像技术创造的一个或多个图像。例如，一个图像可以通过光学显微镜形成以及另一个图像可以通过带电粒子束显微镜形成。在一个示例中，iPALM被用来形成光学图像以及扫描电子束被用来形成一系列图像，并且这些图像被相关。iPALM技术提供了关于样本中具体区域的定位信息，而来自于电子显微镜的图像可以示出样本的总体特性。这个过程在生物样本成像方面是尤其有用的，其中生物样本中的特定蛋白质或其他结构可以用有机染料来在化学上被功能化或在基因上被改性以表示荧光蛋白质，其可以用iPALM来成像。将iPALM数据与来自带电粒子系统的数据相关提供了关于样本的超微结构内荧光标记位置的情境信息。选择合适的带电粒子制备和成像技术，可以构建三维图像来给出特定特征位于样本中何处的极好的视角。

在上文描述的相关显微术示例中，iPALM被用来获得样本的三维超分辨率荧光图像，首先通过顺序定位X-Y图像平面中的感兴趣区域以及从分子坐标（molecularcoordinate）呈递二维超分辨率图像。从每个分子发出的光的同时多相位干涉进一步被用于提取Z轴位置，从而定义第三个维度。使用iPALM成像的相同样本然后由带电粒子系统来成像。带电粒子系统可以循环操作，其中例如聚焦离子束（FIB）去除样本的几纳米厚的层以暴露由SEM所成像的新表面。这个循环可以重复很多次以形成样本中的逐渐更深（ever-deeper）的层的一叠图像。

然而iPALM图像和电子显微术（EM）图像的相关是受限的。用于相关的现有方法涉及使用样本体积和支撑基板的交界面处的基准点的平面层。这允许了X-Y平面中的精确位置信息，但在Z平面中定位不佳。例如，在二维X-Y平面中的相关通过使用如在颁发给Hess等人的美国专利No.7,924,432（“Hess”）中所描述的技术来产生极好的数据。在这个技术中，在X和Y维度中的相关一般是直截了当地。然而，使用Hess的方法的Z平面的相关依赖于经切片的样本的顶表面和底表面之间的插值。这变得有问题，因为样本切片可能经历由于电子和离子束诱发的失真而引起的变化以及由于样本制备和插入到真空中以用于带电粒子处理而在样本中发生的变化。