[发明专利]一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法

说明书

本发明公开一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：采用肝细胞为种子细胞，以多孔蚕丝蛋白支架作为肝细胞体外培养载体，将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上，并将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养；该方法所建立的三维肝细胞共培养体系，不但可以用于组织工程化肝细胞功能单元，而且还可用于体外评价药物对肝代谢酶的影响及肝毒性检测，为新药研发提供新的筛选评价工具。

技术领域

本发明涉及一种肝细胞的体外培养方法，特别是一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法。

背景技术

原代肝细胞不但是构建组织工程化肝脏的理想种子细胞来源，而且也是对药物体外ADME/T性质进行准确评价的重要模型。但肝细胞在传统的体外平面培养过程中极易出现“去分化”，即出现活性的降低，表型的改变以及功能活性（包括合成和代谢活性）的降低甚至完全丧失。研究证实：新鲜分离的人肝细胞在悬浮培养条件下，其P450酶活性仅维持4h；在胶原包被的培养板内，贴壁细胞的P450酶表达量及酶活性在24－48h后便会显著降低。而由于酶功能活性的降低，肝细胞单层培养法在肝毒性药物筛选中的灵敏度仅有50％。因此如何在体外培养中克服或延缓肝细胞的“去分化”现象，从而有效维持肝细胞的理想分化状态，即维持其表型及相关功能一直是肝细胞培养及应用研究中所亟待解决的“瓶颈”问题。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够理想维持肝细胞生长活性，并显著提高体外培养肝细胞表型及功能活性的新培养方法。

本发明的技术解决方案是：一种可提高肝细胞体外分化表型及功能的培养方法，其特征在于：所述的方法按照以下步骤进行：采用肝细胞为种子细胞，以多孔蚕丝蛋白支架作为肝细胞体外培养载体，将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上，并将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养，

所述的将肝细胞、肝源性间质细胞和细胞外基质按一定比例接种到多孔蚕丝蛋白支架上的具体操作步骤如下：将新鲜分离的肝细胞和肝星形间质细胞按照细胞数3:1的比例混合，并将获得的混合细胞与细胞外基质混合，获得细胞-基质混合物，所述的细胞外基质由胶原和基质胶按照体积比为1:1的比例混合而成，然后将细胞-基质混合物多点接种至多个多孔蚕丝蛋白支架，并保证肝细胞数量为600,000cells/支架，基质胶的体积为30μL/支架，

所述的将多孔蚕丝蛋白支架置于模拟肝细胞的体外培养微环境中进行培养的具体操作步骤如下：将接种完成的多孔蚕丝蛋白支架按照1个支架/孔的密度放置到多孔细胞培养板中，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，在37℃、5%CO₂的条件下凝胶化2h，然后向多孔细胞培养板的每个孔中加入共培养基，所述的共培养基为肝细胞培养基和星形间质细胞培养基按照体积比为1:1的比例混合而成。

本发明同现有技术相比，具有如下优点：