[发明专利]YBX1稳定表达的SMCC-7721细胞系及构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体地说涉及一种人YBX1蛋白稳定表达的SMCC-7721细胞系及其构建方法。

背景技术

Y-box结合蛋白(Y-box binding protein)是一类特异性结合目的基因启动子和增强子内部Y-box序列(CTGATTGGCCAA)的转录因子，广泛存在于从细菌到人类的许多物种中。YBX1是Y-box结合蛋白家族的成员之一，分子量为35kD，该基因定位于染色体上1p34。YBX1蛋白从结构上分为三部分：N端结构域、冷激结构域(Cold Shock Domain，CSD)和C端结构域。其中N端结构域的序列在不同物种间变化较大，而CSD中氨基酸残基序列表现出高度的进化保守性，并直接参与识别和结合DNA Y-box序列的过程，C端结构域的序列则具有酸性和碱性氨基酸残基富集区交替出现的特点。近些年的研究表明，YBX1与肿瘤的发生和维持存在广泛密切的联系，发挥多种重要的生理功能。

研究发现，YBX1不仅可以与DNA结合，还可以与mRNA相互作用形成复合体，或抑制其编码蛋白的翻译，或维持mRNA稳定性，或参与mRNA的选择性剪切。YBX1与人类恶性肿瘤关系非常密切，在肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤中发现YBX1异常表达，并与恶性肿瘤的发生、发展呈高度相关性。研究表明，过度表达的YBX1可以通过调控细胞周期蛋白cyclinA和cyclinB来促进肿瘤细胞增殖，而抑制YBX1活性能有效地抑制肿瘤生长。Lasham等研究证实，YBX1通过下调凋亡蛋白表达量或提高抗凋亡蛋白的表达而导致细胞凋亡通路功能异常，致使癌细胞拥有更强的存活力。此外，还有研究发现，YBX1可以作为转录因子参与肿瘤扩散和转移过程，以及诱导肿瘤细胞产生耐药性等生物学功能，但其作用机制尚不清楚。2015年，El Naggar等在《Cancer Cell》报道，YBX1通过直接与HIF1A转录区域结合来上调HIF1а蛋白表达，从而促进肉瘤转移。

肝癌在我国的发病率和死亡率很高，严重危害国民的身体健康。对肝癌发病机制的研究是肿瘤生物学研究的重要课题。目前关于YBX1功能研究主要发生在乳腺癌的增殖、迁移和表皮细胞间质化(Epithelial-to-Mesenchymal Transition,EMT)等方面，而对YBX1蛋白在肝癌发生发展过程中的生物学调控机制报道很少，尤其是YBX1对肝癌能量代谢途径的调控机制尚不清楚。本发明通过慢病毒转染方法获得YBX1稳定表达的SMCC-7721肝癌细胞株，为研究YBX1在肝癌中的调控机制提供有力的实验工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定表达人YBX1蛋白的SMCC-7721细胞系及其构建方法，该细胞株可用于研究YBX1在肝癌细胞中的作用机制与肿瘤能量代谢提供有力工具。

本发明提供的一种稳定表达人YBX1蛋白的SMCC-7721稳定细胞系，是以肝癌细胞系SMCC-7721细胞作为宿主细胞，感染表达YBX1基因的慢病毒培养液，经过Puromycin药物筛选阳性细胞、细胞增殖后获得高效表达YBX1蛋白的稳定细胞系。与对照细胞相比，该阳性细胞系YBX1基因和蛋白表达量显著提高。通过tGFP融合基因表达的绿色荧光蛋白可以指示YBX1的细胞定位和表达水平。

本发明提供的一种稳定表达人YBX1蛋白的SMCC-7721细胞系的构建方法，其慢病毒表达载体pGIPZ-YBX1-tGFP构建方法，包括如下步骤：

(1)利用人工寡核苷酸合成和聚合酶链式反应(PCR)技术，以人正常乳腺癌细胞(HMLE)cDNA为模板扩增YBX1全长基因序列。PCR引物序列为：

YBX1Forward Primer：5'-ATGAGCAGCGAGGCCGAGACCCAG-3'

YBX1Reverse Primer：5'-TTACTCAGCCCCGCCCTGCTCAGC-3'

(2)将扩增的人YBX1全长基因序列克隆到T载体中，构建成T-YBX1重组载体。

(3)利用多重PCR方法，分别以T-YBX1载体为模板扩增YBX1基因，以pGIPZ载体为模板扩增CMV基因和tGFP基因，引物序列如下(括号中表示酶切位点或接头序列，下划线表示基因名称)：

5'(Xba I)-CMV：5'-GTTCTAGACGTATTACCGCCA-3'