[发明专利]一种用于培养细胞的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及干细胞的研究领域，特别是涉及一种新型、高效的无血清培养基及其制备方法和用途。

背景技术

间充质干细胞普遍存在于人体多种组织和器官中，并具有多向分化潜能，具有刺激组织再生、调节免疫等功能，在细胞治疗领域有着广阔的应用前景。

骨髓间充质干细胞已经在临床上得到了广泛应用，而目前的研究表明，脐带来源的间充质干细胞不但能够成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，而且具有更大的应用潜能。其中，源于人脐带的人脐带间充质干细胞(humanUmbilicalCordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)表达多种胚胎干细胞的特有标志，具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题的限制、易于工业化制备等特征，而且研究证实hUC-MSCs在神经疾病、免疫系统、内分泌系统以及癌症、心脏病等疾病的动物模型和临床研究中有良好治疗效果，因此有可能成为最具临床应用前景的多能干细胞。

若要将hUC-MSCs进一步应用于临床，最重要的就是hUC-MSCs的体外大量扩增达到有效的临床治疗剂量，因此hUC-MSCs的体外培养成为了最基础同时也是最重要的技术之一。现有的hUC-MSCs培养方法多采用在基础培养基中添加FBS、青链霉素，但非人血清成分复杂，使hUC-MSCs在长期的培养过程中易分化，且存在传播异种病原体的危险。

此外，虽然已有科研工作者开发出多种类型的血清替代物，但目前市场可购买的供hUC-MSCs培养的血清替代物以及完全培养基的培养效果仍不理想，尤其对于干细胞的贴壁、增殖、以及细胞长期培养后的稳定性的维持等特性均无法达到预期效果。

发明内容

针对上述技术问题，本发明的发明人研究发现，在hUC-MSCs的培养过程中，细胞会分泌多种对自身生长有利的因子、蛋白等成分，可以利用这些成分在无血清环境下进行细胞、特别是干细胞的长期扩增培养。

因此本发明的目的是提供一种用于培养细胞的试剂盒，该试剂盒包括无血清培养基，所述无血清培养基中含有从细胞培养物获得的浓缩液，特别适合在无血清环境下培养细胞。

本发明的技术方案如下。

一方面，本发明提供了一种用于培养细胞的试剂盒，所述试剂盒包括无血清培养基，所述无血清培养基含有a-MEM/DMEM-F12、β-巯基乙醇、非必需氨基酸、重组人碱性成纤维生长因子(b-FGF)和人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的培养上清浓缩液。

优选地，所述无血清培养基包含0.05-0.2体积份的β-巯基乙醇、0.5-2体积份的非必需氨基酸水溶液、4-6体积份的培养上清浓缩液、90-95体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为5-15ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子，其中，所述非必需氨基酸水溶液包含浓度各为8-12mM的甘氨酸、丙氨酸、L-天门酰胺、L-天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸和丝氨酸；

更优选地，所述无血清培养基包含0.1体积份的β-巯基乙醇、1体积份的非必需氨基酸水溶液、5体积份的培养上清浓缩液、94体积份的a-MEM/DMEM-F12和终浓度为10ng/ml的重组人碱性成纤维生长因子。

所述培养上清浓缩液通过包括以下步骤的方法制得：

收集人脐带间充质干细胞培养上清液，离心，微滤膜过滤，超滤浓缩。

优选地，所述培养上清浓缩液通过包括以下步骤的方法制得：

(1)将人脐带间充质干细胞以0.5-4×10⁴个细胞/cm²的密度接种于无血清培养基中培养48-72小时使得细胞达70％-90％汇合，收集新鲜的脐带间充质干细胞培养上清液；

(2)在4℃下以3000-5000g离心15-40min，除去培养上清液中悬浮的细胞以及细胞碎片；

(3)将经步骤(2)得到的上清液在4℃下以10000g离心30-60min，除去上清液中的细胞质及其他杂质；

(4)将经步骤(3)得到的上清液过0.22μm微滤膜除菌；

(5)将经步骤(4)得到的滤过液移入3KD的超滤浓缩管中，在4℃下以3000-4500g离心60-90min，将滤过液浓缩至其体积的1/20至1/50；

(6)将经步骤(5)得到的浓缩液以PBS缓冲液调节终体积为步骤(1)中收集的细胞培养上清液的1/20。

在步骤(1)中，人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)优选为从自然分娩或剖宫产的健康新生儿新鲜脐带组织分离出的人脐带间充质干细胞。