[发明专利]一种提高诱导多能干细胞的体外分化造血效率的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法。

背景技术

血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，其常表现为贫血、出血、发热等症状。

我国儿童恶性癌症的发病率呈上升趋势，截止2014年的数据显示，儿童恶性肿瘤中，白血病的发病率居第一位，约占三分之一。对于恶性血液系统疾病而言，临床上的化疗效果往往不甚理想。自从二十世纪中期Thomas教授首先开展了造血干细胞移植以来，造血干细胞移植广泛地被应用于血液病的临床治疗中，已经成为治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、重型再障等病的有效手段之一。

目前造血干细胞的主要来源是脐带血、骨髓和外周血。造血干细胞移植主要分为自体和异体造血干细胞移植两种。尽管自体移植具有无移植排斥、移植物抗宿主病等并发症的优点，但自体造血干细胞(HSC)中残留存在的肿瘤细胞可能导致移植后疾病复发；相反，异体移植虽然远期疗效优于自体移植且复发率低，但是配型效率极低，来源有限，从而限制了异基因HSC移植的临床应用。

因此，目前迫切寻求更为安全、成本较低、来源稳定简单的造血干细胞资源。而胚胎干细胞和iPS细胞定向分化为造血干细胞技术的研究有望解决这一难题。

研究表明，小鼠、猴子和人的胚胎干细胞(ESCs)在体外都可以被诱导造血分化。由于胚胎干细胞及其衍生物存在取材困难、免疫排斥、伦理道德等问题，而iPS细胞不存在上述问题，因此其成为很好的研究对象并有望应用于临床。

iPS细胞被称为全能性细胞，在体外能被诱导分化成多种来自各个胚层的细胞，例如造血细胞、神经前体细胞、心肌细胞和生殖细胞衍生的细胞等。iPS细胞这一特性将可能为揭示造血干细胞的发生过程提供一个较好的研究平台，同时可帮助深入了解各类血液病的发病机制并为其治疗带来曙光。

目前，已有多种体外诱导方法被报道，例如：与基质细胞共培养法、拟胚体形成法及单层诱导等方法。但是，何种方法效率最高并没有严格的报道。这对于未来医学个体化干细胞治疗来说，缺乏了体外分化为造血干细胞的准则。因此更加亟需规范的准则。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法，该方法使用OP9与iPSCs体外共培养，通过鸡尾酒式添加法添加细胞因子，旨在提高体外造血分化效率。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种提高诱导多能干细胞(iPS细胞)体外分化为造血干细胞效率的方法，包括以下步骤：

(1)将OP9细胞(小鼠骨髓基质细胞)培养至过密状态；

(2)将iPS细胞用PBS洗涤2遍后加入Dispase(分散酶)消化，待克隆的边界出现轻微卷缩后吸走Dispase，再加入DMEM/F12培养基，用枪头将克隆吹散至成均匀块状，然后移至离心管中待其自然沉降，弃上清，加入分化培养基；

(3)将已培养至过密状态的OP9细胞的培养基也更换为分化培养基；然后将步骤(2)得到的iPS细胞接种到OP9细胞中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养一天后，第二天全部换液将死细胞及未贴壁细胞去除，之后隔天对半换液以提高分化效率，在第14天收取造血干细胞；

步骤(1)所用的培养基是α-MEM培养基加入20％胎牛血清；

本发明所述的分化培养基是α-MEM培养基加入10％胎牛血清、100umol/L硫代甘油(MTG)，以及加入40ng/ml的干细胞因子(stemcellfactor，SCF)、20ng/ml的骨形态发生蛋白4(BMP4)、20ng/ml的白细胞介素-3(IL-3)、20ng/ml的白细胞介素-6(IL-6)和20ng/ml的血小板生成素(TPO)；

本发明所述的诱导多能干细胞是用从外周血分离出的单个核细胞利用Invitrogen的仙台病毒重编程试剂盒(A16517)诱导而成。