[发明专利]一种提高家蚕幼虫体重量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种提高蚕重量的方法，尤其是涉及了一种提高家蚕幼虫体重量的方法。

背景技术

家蚕(Bombyxmori)是当今地球上室内饲养量最大的经济资源昆虫，它从桑叶(饲料)中摄取各种营养物质，并通过代谢生理过程供给蚕体内各个组织器官而进行生长、发育、繁殖等。家蚕大规模饲养分为蚕茧生产和蚕种生产二种类型，蚕茧生产的主要目的是获取优质、高产的茧丝，它与家蚕幼虫生长与代谢生理过程调控密切相关。

神经肽在昆虫的生长与物质能量代谢等重要生理过程调控中发挥重要作用。在家蚕中存在有近40种神经肽，Corazonin是其中之一，其生理功能由Ventra于1989首次鉴定，并由Hua等于2000年首次在家蚕中分离到。家蚕Corazonin的作用是通过家蚕Corazonin受体(BmCrzR)来介导的，但有关BmCrzR介导Corazonin作用，来调控家蚕幼虫生长与物质能量代谢等，均缺乏研究。

发明内容

为了解决背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种提高家蚕幼虫体重量的方法，是采用Rt-PCR克隆，PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳回收，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，与T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合反应，再给家蚕幼虫腹部注射的方法，通过调控家蚕物质能量代谢，提高家蚕幼虫体重量。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1)解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，从中提取总RNA，然后逆转录获得第1链cDNA；

2)以第1链cDNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA；

3)再以BmCrzRcDNA为模板，通过PCR扩增得到BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，经HindIII/BamHI酶切后，与哺乳动物表达载体pFlag-CMV-3'连接，获得pFLAG-BmCrzR；

4)以pFLAG-BmCrzR为模板，通过PCR扩增得到pFLAG-BmCrzRDNA片段，琼脂糖凝胶电泳回收得到纯化的大小为893bp的目的DNA片段，作为反应模板；

5)将反应模板与10×T7反应缓冲液、ATP液、CTP液、GTP液、UTP溶液、T7酶混合进行反应，然后进行多次处理得到BmCrzRdsRNA；

6)给四龄第2-3天的家蚕腹部注射10-20μgBmCrzRdsRNA，用桑叶继续饲养，获得重量增加的五龄盛食期家蚕幼虫体。

所述步骤1)具体为：解剖并收集五龄第3-4天的家蚕丝腺，使用Trizol试剂盒提取总RNA，再用逆转录第1链cDNA合成试剂对总RNA进行逆转录；其逆转录条件是：65℃变性5min，42℃反应60min，70℃灭活15min，获得第1链cDNA。

所述步骤2)具体为：以第1链cDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTGCCACCATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’(如SEQIDNO.1的引物1)和反向引物5’-GGATCCCGTAACAAACTAATGTTCTGTCCATTCG-3’(如SEQIDNO.2的引物2)进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增，克隆获得家蚕Corazonin受体(BmCrzR)cDNA。

所述的逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，进行30个循环。

所述步骤3)得到BmCrzRDNA片段具体采用以下方式为：以BmCrzRcDNA为模板，分别用正向引物5’-AAGCTTATGGACAACGAAGGCAACAGTAC-3’(如SEQIDNO.3的引物3)和反向引物5’-GGATCCTTATAACAAACTAATGTTCTGTCCAT-3’(如SEQIDNO.4的引物4)进行PCR扩增，其PCR扩增条件是：94℃预变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，加rTaq酶继续延伸15min，得到DNA片段。