[发明专利]检测ALDH2基因多态性的引物、探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因多态性检测技术领域，具体涉及检测ALDH2基因多态性的引物、探针和试剂盒。

背景技术

人类乙醛脱氢酶(aldehydedehydrogenasegene,ALDH)是一种四联体蛋白，催化乙醛和其他脂肪族醛氧化，目前已经发现19种ALDH基因，在其19种同工酶中，存在于肝脏线粒体内的ALDH2活性最强。

ALDH2具有乙醛脱氢酶的活性，是人体内酒精代谢的关键酶，能够将有害产物乙醛转化为无害的乙酸，从而起到解毒的作用。ALDH2同时也具有硝酸酯酶活性，临床上治疗及预防冠心病心绞痛的常用药物硝酸甘油也是由其代谢的，硝酸甘油经ALDH2代谢，释放一氧化氮(NO)，NO能激活鸟苷酸环化酶，使平滑肌和其他组织内的环鸟苷酸(CGMP)增多，导致肌球蛋白轻链去鳞酸化，调节平滑肌收缩状态，引起血管扩张，从而有效预防冠心病和心绞痛。

人类ALDH2基因位于12号染色体，包含13个外显子，其12号外显子1510位(rs671SNP)的鸟嘌呤(G)突变为腺嘌呤(A)时，导致该基因编码蛋白504位的谷氨酸(Glu)替换为赖氨酸(Lys)，即Glu504Lys(rs671)。这个位点突变使ALDH2失去结合辅酶的能力，造成酶活性的丧失，严重影响酒精、硝酸甘油等的代谢。人群中该酶基因型有3种情况，具有正常催化活性的野生纯合子型:ALDH2*1/1；活性下降的杂合子型:ALDH2*1/2(约为正常ALDH2活性的6.25％),催化活性失去的突变纯合子型ALDH2*2/2。同时ALDH2表现出明显的遗传多态性，在不同的地域、民族、人种中其频率不同。其在欧美白种人中少见，而在中、日、韩等东亚黄种人中突变率高达30％～50％。

研究显示，在饮酒人群中，尤其是重度饮酒者，ALDH2基因多态性与酒精性中毒、酒精性肝病(alcoholicliverdisease,ALD)、消化道癌症等疾病密切相关，ALDH2*2突变人群患肝癌、食道癌、口腔癌的概率分别是ALDH2*1野生人群的3倍、12.95倍、11.72倍以上，ALDH2*2突变是增加区域性癌化几率的重要因素之一。另外，ALDH2*2突变导致硝酸甘油代谢速率大大降低，从而无法产生一氧化氮，难以发挥药效。因此对ALDH2基因突变的检测能够指导人们根据自己的基因型正确饮酒，从而减少酒精引起的身体伤害，真正做到健康饮酒。也能为医生合理使用硝酸甘油提供有力参考，减少用药无效导致的意外死亡。

目前，针对ALDH2基因多态性检测的方法有多种，最简单的方法是PCR-RFLP，但该方法操作复杂，样本多时易造成PCR产物的交叉污染且容易出现酶切不充分或酶切过度而出现假阴性或假阳性的结果，可靠性低。DNA测序法虽然是金标准，但步骤繁琐，过程复杂，容易出现样本间的交叉污染而导致测序失败，另外测序仪价格超出了一般临床检验实验室的承受范围。高分辨率溶解曲线法，快速，简便，经济实用，但是受仪器温度控制，假阳性高。

发明内容

为了解决现有技术中对于ALDH2基因检测方法的上述不足，本发明在Taqman探针法的基础上提供一种具有高灵敏度、高特异性、高准确度、高精确度、操作方法简单的ALDH2多态性位点的引物和探针。

本发明提供的检测ALDH2基因多态性的引物和探针，其探针为公用的Taqman探针，其核苷酸序列5’端标记报告基团，3’端标记淬灭基团；引物的核苷酸序列如下：

突变型ARMS上游引物：

SEQIDNO:1(5’-TCCCACACTCACAGTTATCACGTT-3’)；

野生型ARMS上游引物：

SEQIDNO:2(5’-TCCCACACTCACAGAATTCACTTC-3’)；

公用的下游引物：

SEQIDNO:3(5’-GGTCAACTGCTATGCTCTGATTGG-3’)。

上述引物针对G1510A位SNP位点设计。引物及探针使用的具体原理是：针对突变位点分别设计野生型和突变型ARMS引物和Taqman探针，结合荧光定量PCR反应，对从人外周血细胞或口腔拭子等组织中提取的基因组DNA进行检测，通过实时荧光PCR仪上收集信号，计算野生型和突变型的△Ct值来确定样本DNA的基因型。

优选地，探针的核苷酸序列如SEQIDNO:4所示，5’端标记的报告基团为FAM，3’端标记的淬灭基团为MGB。

探针SEQIDNO:4：5’-FAM/CCGTACTCCCCAACT/MGB-3’。