[发明专利]一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于基因测序法的HLA-B27基因分型的方法。

背景技术

近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病人大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。

HLA-B27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有有核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B27抗原的表达与强直性脊柱炎有高度相关性，超过90％的强直性脊柱炎患者其HLA-B27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10％的为阳性，而强直性脊柱炎由于症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B27的检测在疾病的诊断中有着重要意义。

强直性脊柱炎(AS)是一种以骶髂关节和中轴关节慢性炎症为主的、原因不明的自身免疫性疾病，以侵犯脊柱为主，早期表现为滑膜炎和韧带附着点的病变，晚期由于韧带钙化造成脊柱强直，目前本病的发病原因和致病机制尚未完全明确。患者早期症状与腰椎间盘突出症、骶髂关节炎、腰背肌筋膜炎等相似，在X线片上没有骶髂关节炎的明确表现，因此在临床诊断上容易混淆而致误诊，延误病情早期治疗，失去最佳治疗时机，导致中、晚期不可逆症状出现，最终发生关节强直甚至致残。赖建铭等通过对AS家系调查发现，HLA-B27阳性的幼年AS患者中69％有脊柱关节病家族史，其中90％为一级亲属，显示AS有明显的家族聚集性，说明AS的危害性很大。因此，早期诊断对控制患者病情发展、减轻畸形、维持和改善功能，具有相当重要的意义。应尽可能地在肯定的放射学骶髂关节炎出现之前进行诊断。在脊柱性关节病这一类的疾病中除了强直性脊柱炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B27抗原的表达有着或多或少的相关性，因此HLA-B27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。

文献报道指出，①HLA-B27阴性和阳性患者男性发病率明显高于女性，阴性与同性别阳性患者平均发病年龄明显偏晚；②HLA-B27阴性患者以31～45岁为主，阳性患者以16～30岁为主；③HLA-B27阴性和阳性患者首发症状均以中轴关节炎和外周关节炎为主。阴性和阳性患者主要临床表现上均以出现下腰疼痛，髋部疼痛为主。阴性患者出现全身症状(包括发热、盗汗和乏力)明显少于阳性患者。总之，HLA-B27阴性患者比同性别阳性患者平均发病年龄明显偏晚，部分阴性患者病情相对较轻。HLA-B27阴性和阳性患者发病上的差异在对HLA-B27检测阴性的疑似患者诊断中应得到重视。

目前可用于检测HLA-B27的方法有流式细胞法、ELISA法、PCR-SSP法、测序法、荧光PCR法等，但这些方法都存在不同程度的缺点。流式细胞法要求标本新鲜，不能长期保存，因此不利于进行实验室间质量评价；且该方法原理基于抗原抗体结合反应，而HLA-B27的单克隆抗体会与其它HLA-B等位基因产物发生不同程度的交叉反应，出现假阳性结果。ELISA法成本低，结果数据客观，但操作复杂，影响反应因素较多，结果准确性差，且固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此每次测定均需作标准曲线。PCR-SSP法需要凝胶电泳，多用于科研无法在医院推广。测序法最为准确，通常检测分析周期稍长，分析样本较多时，若无前期筛选(阳性结果的初步筛选)，其工作量较大，且往往需要重复确认(当扩增不出结果时需要仔细分析确认扩增条件和扩增结果)；荧光PCR方法，采用荧光染料对扩增的特异片段产生信号，通常扩增片段较小，无法进一步对HLA-B27进行分型。

虽然上述方法在临床HLA-B27检测上扮演着重要角色，但却各有其缺陷，一种操作简便、快速、且准确度高的检测方法的开发将起到关键性临床作用。目前尚无文献报道利用荧光PCR结合基因测序技术检测HLA-B27不同基因亚型的方法。

发明内容

为解决现有技术针对HLA-B27基因进行检测分型中存在的技术问题，本发明提供一种能够快速、灵敏、特异的对HLA-B27基因进行分型的方法。