[发明专利]一种利用短链引物阻遏提高DNA克隆及组装效率的方法

权利要求书

1.一种阻遏环状质粒中的目的片段和骨架载体酶切后重新连接的方法，包括如下步骤：

1）在环状质粒的目的片段两侧添加DNA片段甲和DNA片段乙，得到环状重组载体，所述环状重组载体从上游起依次包括所述DNA片段甲、所述目的片段、所述DNA片段乙和所述骨架载体；

所述DNA片段甲的两端分别为限制性内切酶A的识别切割序列和限制性内切酶B的识别切割序列，

所述DNA片段乙的两端分别为限制性内切酶C的识别切割序列和限制性内切酶D的识别切割序列；

用所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B、所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D酶切所述环状重组载体后形成的黏性末端依次记作：骨架载体黏性末端1、DNA片段甲上游黏性末端、DNA片段甲下游黏性末端、目的片段上游黏性末端、目的片段下游黏性末端、DNA片段乙上游黏性末端、DNA片段乙下游黏性末端、骨架载体黏性末端2；

所述黏性末端满足如下条件：

所述目的片段上游黏性末端与所述骨架载体黏性末端1和所述骨架载体黏性末端2均不匹配，

所述目的片段下游黏性末端与所述骨架载体黏性末端1和所述骨架载体黏性末端2均不匹配，

所述目的片段上游黏性末端与所述目的片段下游黏性末端不同且不匹配；

2）用所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B、所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D酶切所述环状重组载体，得到酶切产物；

3）将所述酶切产物、短链引物A和短链引物B退火，即实现了阻遏所述目的片段和所述骨架载体酶切后重新连接；

所述短链引物A与所述DNA片段甲互补配对，以阻遏所述目的片段和所述骨架载体酶切后重新连接；

所述短链引物B与所述DNA片段乙互补配对，以阻遏所述目的片段和所述骨架载体酶切后重新连接。

2.一种用于将m个待拼接DNA片段拼接到接收载体上的成套产品，其由m个环状重组载体、接收载体x、短链引物A和短链引物B组成；

所述m个环状重组载体按照待拼接DNA片段的拼接顺序依次命名为环状重组载体1、环状重组载体2、……、环状重组载体m；

所述m为大于等于2小于等于7的整数；

所述环状重组载体1从上游起依次包括DNA片段甲1、待拼接DNA片段1、DNA片段乙1和骨架载体；

所述环状重组载体2从上游起依次包括DNA片段甲2、待拼接DNA片段2、DNA片段乙2和骨架载体；

依次类推，

所述环状重组载体m从上游起依次包括DNA片段甲m、待拼接DNA片段m、DNA片段乙m和骨架载体；

所述接收载体x从上游起依次包括DNA片段甲x、待替换DNA片段x、DNA片段乙x和骨架载体；

每个所述环状重组载体中的DNA片段甲的两端分别为限制性内切酶A的识别切割序列和限制性内切酶B的识别切割序列，

每个所述环状重组载体中的DNA片段乙的两端分别为限制性内切酶C的识别切割序列和限制性内切酶D的识别切割序列，

用所述限制性内切酶A、所述限制性内切酶B、所述限制性内切酶C和所述限制性内切酶D酶切每个所述环状重组载体后形成的黏性末端依次记作：骨架载体黏性末端1、DNA片段甲上游黏性末端、DNA片段甲下游黏性末端、待拼接DNA片段上游黏性末端、待拼接DNA片段下游黏性末端、DNA片段乙上游黏性末端、DNA片段乙下游黏性末端、骨架载体黏性末端2；

所述黏性末端满足如下条件：

每个所述待拼接DNA片段上游黏性末端与任一个环状重组载体的骨架载体黏性末端1和任一个环状重组载体的骨架载体黏性末端2均不匹配；

每个所述待拼接DNA片段下游黏性末端与任一个环状重组载体的骨架载体黏性末端1和任一个环状重组载体的骨架载体黏性末端2均不匹配；

每个所述待拼接DNA片段上游黏性末端与所述待拼接DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；

待拼接DNA片段1下游黏性末端与待拼接DNA片段2上游黏性末端匹配；

待拼接DNA片段2下游黏性末端与待拼接DNA片段3上游黏性末端匹配；

依次类推；

待拼接DNA片段m-1下游黏性末端与待拼接DNA片段m上游黏性末端匹配；

所述接收载体x经限制性内切酶酶切产生的载体骨架上游黏性末端与待拼接DNA片段1上游黏性末端匹配；

所述接收载体x经限制性内切酶酶切产生的载体骨架下游黏性末端与待拼接DNA片段m下游黏性末端匹配；

所述短链引物A与所述DNA片段甲互补配对，以阻遏待拼接DNA片段和所述重组环状载体的骨架载体酶切后重新连接；

所述短链引物B与所述DNA片段乙互补配对，以阻遏待拼接DNA片段和所述重组环状载体的骨架载体酶切后重新连接。