[发明专利]一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基及方法

说明书

技术领域

本发明属于海洋贝类的细胞培养技术领域，具体涉及一种培养栉 孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基及方法。

背景技术

细胞培养是生物工程中的重要手段和常用方法之一，已广泛应用 于染色体分析、细胞代谢、基因表达、免疫、癌变机制、病毒培养、 分离、鉴定和药物筛选等研究领域。贝类组织培养工作从20世纪60 年代末期开始，已见报道的有牡蛎、贻贝、文蛤等十几种。国内从 20世纪80年代开始进行该领域的研究。细胞培养是否成功的关键是 能否创造适宜的环境使体外细胞能够持续增殖，目前还没有一种针对 海洋贝类的细胞培养基，为了更好地使贝类细胞生长，许多研究者对 此进行了大量的添加因子等探索性研究。但由于海洋贝类细胞培养多 模仿哺乳动物细胞培养流程，培养基也是在哺乳动物细胞培养基的基 础上做出改动，而海洋贝类细胞对营养的要求与哺乳动物细胞有所差 异，使得海洋贝类细胞生长和分裂缺乏适宜的营养因子。因此，虽然 经过了近半个世纪的努力，仍没有建立起海洋贝类的永生性细胞系， 其细胞培养多停留在原代培养和有限细胞系水平上。许多研究者希望 通过添加因子优化培养基来建立海洋贝类细胞系。

另外，体外培养的细胞种类也至关重要，常见的细胞培养种类有 成体组织细胞，如鳃细胞、外套膜细胞、血细胞、心脏细胞、神经细 胞等，然而成体组织细胞在体外分裂增殖能力有限，因此并非理想的 细胞培养种类来源。发育早期的胚胎或幼虫细胞通常具有更大的有丝 分裂潜能，并且细胞多处于低分化水平或者未分化的干细胞状态，这 一特性使胚胎或幼虫细胞成为细胞培养的最佳实验材料。海洋贝类是 海洋生物中的重要类群，其胚胎外由于有膜包被不易获得单细胞，因 此，幼虫细胞是海洋贝类具有体外培养前景的细胞来源。栉孔扇贝 (Chlamysfarreri)隶属于软体动物门(Mollusca)、瓣鳃纲 (Lamellibranchia)、珍珠贝目(Pterioida)、扇贝科(Pectinidae)、扇 贝属(Pecten)，是仅产于我国北部沿海的经济贝类，为我国北方重 要的养殖品种。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系 的培养基及方法，旨在解决现有技术无法实现贝类细胞传代培养的问 题。

本发明具体通过以下技术方案实现：

一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养基，所述的培养基包括 以下组分：13.7g/l的L-15基础培养基、20.2g/lNaCl、0.54g/lKCl、 0.60g/lCaCl₂、1g/lMgSO₄、3.9g/lMgCl₂及终浓度为5％的胎牛血清、 2mmol/L的谷氨酰胺、1％的栉孔扇贝卵黄提取液、1％的栉孔扇贝血 清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，pH为7.2-7.4。

本发明所述的栉孔扇贝血清通过以下方法制备：于闭壳肌中抽取 栉孔扇贝血淋巴，置于无菌容器中4℃静置过夜，次日将上清液以 2000g离心10min，收集上清后分别经0.45μm和0.22μm孔径的微 孔滤器过滤除菌，分装后置于-20℃保存。

本发明所述的栉孔扇贝卵黄提取液通过以下方法制备：解剖成熟 期的栉孔扇贝卵巢，置于灭菌的海水中清洗3遍，用剪刀将卵巢剪碎 至乳糜状；取1ml乳糜状的组织到15ml离心管中，加入10ml无 钙镁离子磷酸盐缓冲液；冰上超声破碎3min，功率200W；结束后 静置5min，再4℃，8000g，离心1h；收集上清液经0.45μm、0.22 μm微孔过滤除菌后分装到1.5ml离心管中，每管1ml，封膜，冻存 备用。

所述的无钙镁离子的磷酸盐缓冲液通过以下方法配置：0.2g/l KCl、0.2g/lKH₂PO₄、30g/l、2.16g/lNa₂HPO₄·7H₂O的水溶液，使用 超纯水作为溶剂，调节pH至7.2-7.4后高压灭菌，置于4℃保存。

本发明的另一目的在于提供一种培养栉孔扇贝担轮幼虫细胞系 的方法，利用所述培养基进行担轮幼虫的单细胞原代培养，实现早期 传代并进行传代培养，具体包括以下步骤：

1)单细胞的获取