[发明专利]抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用。

背景技术

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，全球每年有上百万妇女患乳腺癌，几十万人死于乳腺癌。在西欧、北美等发达国家，乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位。在我国近年来乳腺癌发病率增长趋势明显，在一些城市已成为女性恶性肿瘤发病的首位。乳腺癌已成为妇女健康的最大威胁。

内分泌治疗是乳腺癌主要治疗方法之一，已成为乳腺癌治疗的重要组成部分。影响乳腺癌内分泌治疗效果的主要因素是雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的表达情况。有学者统计，ER⁺/PR⁺患者TAM治疗有效率约60-75％，ER⁺/PR^-患者下降至35～50％，并且，即使是ER^-/PR^-患者接受TAM治疗后仍然有5％的患者可以从中获益。接受TAM治疗的ER⁺/PR⁺患者复发及死亡相对危险性与ER⁺/PR^-患者相比下降15％～30％，说明PR对内分泌治疗效果有较大的影响。

孕激素受体(PR)属于核受体家族转录因子，通过和孕激素结合导致受体二聚化，与特定靶基因启动子区的顺式作用元件结合，调节敏感靶基因的转录。PR是孕激素作用的靶点，其可促进孕激素刺激激素依赖性乳腺癌细胞的生长。PR至少包括两种不同亚型即94kD的hPR-A和116kD的hPR-B,在正常子宫内膜及乳腺上皮细胞中表达，同时也在部分乳腺癌的肿瘤细胞中表达，是乳腺癌预后及激素治疗的重要指示因子。同时，PR也在一些卵巢癌和子宫内膜癌病患肿瘤细胞中表达。

目前在临床上通常用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)病理实验检测肿瘤细胞中PR的表达状况；而在科研上则多用蛋白印记和流式细胞术等方法来检测PR的表达水平；但这些实验方法的核心为特异性结合PR的单克隆抗体，其性能的优劣直接决定着整个检测的灵敏度和特异性。因此，研制出一种结合特异性较高的针对PR蛋白的单克隆抗体具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗PR单克隆抗体和应用，提高所述杂交瘤细胞产生的单抗与PR蛋白的结合特异性并应用到相关产品的制备中。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CGMCCNO：11083。

本发明所述抗PR蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获得：

(1)重组表达载体的构建：根据PR片段(1-298aa，PR-N298)ORF核苷酸序列(PR-N298ORF核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，894p；PR-N298氨基酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物进行PCR扩增，基因两侧分别引入限制性内切酶位点EcoRI和BglII，插入表达载体pET-23b(货号Cat.No.69771-3，Novagen公司)，构建PR-N298片段重组表达质粒pET-23b/PR-N298；

(2)PR片段重组蛋白的表达与纯化：将PR片段重组表达质粒转化E.Coli感受态细胞，挑单克隆扩增培养，IPTG诱导后收获细菌，裂解离心取上清，NTA亲和层析柱纯化，获得纯化的PR重组蛋白片段；

(3)单克隆抗体的筛选与制备：采用上述纯化的PR重组蛋白片段免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾脏细胞与SP2/0细胞进行融合，有限稀释法获得单克隆，ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，获得能分泌抗PR特异性抗体的杂交瘤细胞株；通过无血清培养基制备抗体，通过亲和层析柱纯化获得PR单克隆抗体。分别通过蛋白印记(Western-Blot)、流式细胞术(FC)、免疫组化(IHC)检测实验验证该单克隆抗体的灵敏度和特异性。

经过上述方法制备后，筛选出能够稳定分泌抗PR单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为UMAB136，亚型鉴定为IgG2a，并于2015年7月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：11083。