[发明专利]一种胞内生产克氏原螯虾NADH脱氢酶亚基I蛋白的方法

权利要求书

1.一种高效表达克氏原螯虾NADH脱氢酶亚基I蛋白的基因工程菌，是将nad1基因导入E.coliBL21(DE3)得到的基因工程菌。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述nad1基因的核苷酸序列如GeneBank中SequenceID：AFQ31571的序列所示。

3.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其步骤如下：

(1)设计引物nad1-1：(5′-TCAGGAGGTACCATATTGGTTATAGTTGTT-3′)和nad1-2：(5′-ACTGAGGTCGACCTACAATACTAAAAATCAAGTA-3′)，利用PCR将克氏原螯虾NADH脱氢酶亚基I基因nad1的cDNA编码框5’和3’两侧分别引入KpnΙ和SalI限制性酶切位点；

(2)通过双酶切、分子连接等基因操作将nad1基因插入到表达质粒pColdII，构建重组质粒pColdII-nad1；

(3)随后将pColdII-nad1转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)，通过氨苄抗生素平板筛选阳性转化子并进行测序验证；

所述限制性酶切位点以加下划线的字母表示。

4.一种以权利要求1所述基因工程菌生产NADH脱氢酶亚基I蛋白的方法，其步骤如下：将重组表达质粒pColdII-nad1转化大肠杆菌BL21(DE3)。含重组质粒的工程菌在37℃条件下剧烈震荡培养至OD₆₀₀≈0.5，随后转入15℃培养并加入终浓度为0.1mM的IPTG，诱导表达24h，转速180rpm。收集菌体，SDS-PAGE分析全菌总蛋白显示，基因工程菌经诱导后有明显的特异表达条带，条带分子量与预期大小分子量～34.5kD一致。在此条件下，重组NADH脱氢酶亚基I蛋白的表达量约占菌体总蛋白量的48％，大部分为可溶性状态。