[发明专利]一种肝微粒体中右啡烷浓度的UPLC/MS/MS检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及药物的检测方法，具体涉及肝微粒体中右啡烷浓度的UPLC/MS/MS检测方法。

背景技术

CYP450酶是参与药物代谢的主要酶系，包括CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4等与药物代谢密切相关的同工酶。研究表明，大部分药物-药物相互作用的发生与CYP450酶活性的诱导和抑制相关，其中主要由酶抑制引起。利用体外方法进行药物代谢研究，可有效缩短新药研发周期，直接观察酶对底物的选择性代谢和底物对酶的诱导和抑制，确定药物代谢途径，预测体内潜在的药物相互作用。目前，常用的体外方法为探针药物法，该方法通过建立肝微粒体温孵体系，从而建立了药物代谢研究模型。

右啡烷(Dextrorphan)是CYP2D6探针底物右美沙芬的代谢产物。因此，目前亟需一种肝微粒体中右啡烷浓度的检测方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种肝微粒体中右啡烷浓度的UPLC/MS/MS检测方法，包括以下步骤：

(1)建立肝微粒体温孵体系，加入内标物和系列浓度的右啡烷对照品，制备标准曲线样品；

(2)将标准曲线样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪进行检测；

色谱条件如下：

色谱柱：C18色谱柱；

流动相：流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液,等度洗脱：A:B＝65:35；

流速梯度洗脱，洗脱程序为：

运行时间为3分钟；

质谱条件如下：

离子源：电喷雾离子源；

检测方式：正离子多反应监测；

根据检测结果得到右啡烷的标准曲线；

(3)按照步骤(1)相同的方法，将底物右美沙芬与肝微粒体温孵体系共温孵，制备得到含有内标物的待测样品，将待测样品注入UPLC/MS/MS液质联用仪，按照步骤(2)相同的条件进行检测，根据标准曲线得到待测样品中的右啡烷浓度。

其中，温孵的时间为20min。

优选地，所述内标物为邻甲苯海拉明。

优选地，所述色谱条件中，流动相的流速为0.3mL/min。

优选地，所述色谱条件中，柱温为40℃。

优选地，所述色谱条件中，色谱柱为ACQUITYUPLC-BEHC18色谱柱，规格为1.7μm,2.1×50mm。

优选地，所述色谱条件中，进样量为0.2μL。

优选地，所述正离子多反应监测中，右啡烷的母离子-子离子对为m/z258.12→m/z157.07，锥孔电压为14V，碰撞电压为36V；邻甲苯海拉明的母离子-子离子对为m/z270.10→m/z181.08，锥孔电压为15V，碰撞电压为12V。

优选地，所述质谱条件中，毛细管电压为3000V，离子源温度为150℃，去溶剂化温度为350℃，去溶剂化气体流速为800L/h。

优选地，所述质谱条件中，锥孔气体流速为150L/h，雾化气压力为7.0bar。

优选地，所述步骤(1)的标准曲线样品制备方法为：将右啡烷加入肝微粒体温孵体系，所述肝微粒体温孵体系包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl2、PBS和NADP，再加入含内标的乙腈溶液，混匀，离心，取上清液，即得标准曲线样品。

其中，标准曲线样品的制备可以按照下述方法进行：分别将系列浓度的对照标准品右啡烷加入肝微粒体温孵体系(包含肝微粒体、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、MgCl₂、PBS和NADP)，再加入含内标的乙腈溶液，充分混匀3min，于4℃，13000rpm离心10min，取上清液即得。肝微粒可以采用人、大鼠、小鼠、犬、恒河猴、食蟹猴的肝微粒。

本发明专一地检测对肝微粒体中的右啡烷浓度，色谱分析时间仅需3分钟，进样量仅需0.2μL，分析时间短、灵敏度高、进样量小。同时，本发明检测方法专属性强、基质效应小、线性范围广、批内和批间准确度与精密度高、进样盘稳定性高，符合方法学验证要求，适用于肝微粒体温孵样本中右啡烷浓度的测定，具有广泛的应用前景。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。