[发明专利]一种同时高效提取RNA和DNA的方法及试剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种同时高效提取RNA和DNA的方法及试剂。

背景技术

在生物及生物技术的研究和应用中，RNA的提取已经成为重要的基本实验技术。尽管已经建立了多种提取方法，但对于特定的材料和不同的实验室，需要从材料、可利用的试剂及基金等方面考虑从而做出不同的选择。此外，提取的RNA的质量直接影响后续的研究结果。

通常采用异硫氰酸胍、盐酸胍、饱和酚等强变性剂来提取细胞或组织的总RNA。异硫氰酸胍和盐酸胍都是强烈的蛋白变性剂，不仅能有效解离核蛋白和核酸的复合体，还能强烈抑制RNA酶的活性，并且与加入的β-巯基乙醇共同对RNase产生强烈的抑制作用。这种方法的优点在于用了强烈的蛋白变性剂，对细胞本身和提取液中的RNase的活性有非常好的抑制效果。

为了提高RNA提取的效率，GIBCOBRL公司提出了“硫氰酸胍-酚-氯仿”抽提法，即TRIZOL法。TRIzol主要成份是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。无论是人、动物、植物还是细菌组织，TRIzol法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≥1g)和细胞(>10⁷)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA印迹分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。TRIZOL试剂能使不同种属不同分子量大小的多种RNA析出。因此，TRIZOL法的特点是快速，高效，获得RNA浓度高、纯度高，不需要超速离心或多步酚-氯仿抽提。

以上两种方法虽然均能较好的提取大部分组织和细胞中的总RNA，但是，由于准备试剂种类多，操作步骤多，耗时长，一般提取一次需花费2小时左右，并且由于操作手法问题，会造成不同批次RNA提取的质量或浓度相差过大，且RNA质量很容易受环境中RNAse的破坏。

为了简化RNA提取方法，提高提取效率，目前市面上也有一些组装开发的试剂盒。Invitrogen公司的RNAMiniKit，利用快速脱盐法去除污染的大分子物质，能从大量样本中纯化出总RNA；Promega公司的TotalRNAIsolationSystem，采用离心或抽滤技术，用高浓度的亚硫氰胍稀释细胞，使RNA酶失活，并选择性的沉淀胞内蛋白，可从组织，细胞，细菌和血液中直接提取RNA，具有高效，快速的特点；Qiagen公司的RNAIsolationMiniKit含RNA稳定剂，使RNA保持原有的表达模式，应用硅胶膜技术和柱式离心技术，用RNase-FreeDNaseset，在分离RNA的过程中直接在纯化离心柱上消化DNA，最后洗脱得到纯净的RNA，该试剂盒步骤简单，无需酚-氯仿抽提，也不用进行繁琐的RNA沉淀，且RNA产物中不含5SrRNA，tRNA或其他低分子量RNA；Ambion公司的RNAwizTMKit利用一步法提取，可在1h内完成，并可大量提取RNA；上海生工的TRIZOL总RNA抽提试剂盒(UNIQ-10柱式)，利用柱式离心技术，可从组织，细菌和细胞中提取200个碱基以上的总RNA；北京天根的RNApreppureCellKit利用高效、专一结合核酸的离心吸附柱和独特的缓冲系统，从培养细胞或细菌中分离纯化高质量的总RNA。使用试剂盒提取细菌总RNA主要有以下优点：速度快，一般不超过1h；提取试剂中一般含有抑制RNA酶活性的成分，能较好的防止RNA降解，得到的RNA纯度和浓度较高。试剂盒提取虽然效率高，获得的RNA质量高，并且能同时处理大量样本，但是价格较高，一般通用型的50次总RNA提取试剂盒价格为1000元左右，如果是国外品牌价格会在这个基础上高出2-3倍。尤其在需要大量长期提取样本RNA时，花费过大，不能普遍适用于广大的实验室。

针对以上缺点，研发一种快速、高效、廉价的RNA提取方法及试剂具有重要的现实意义。

发明内容