[发明专利]小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种两栖动物皮肤显微组织切片的制备方法，具体涉及用于显微观察的小鲵科动物皮肤组织切片的制备方法，属于显微组织切片技术领域。

背景技术

皮肤是两栖动物机体的第一道天然屏障，在适应和进化的过程中，担任了呼吸、调节水平衡、离子运输、抵抗猎食者、抗细菌、真菌等多方面的功能，这些功能体现了皮肤形态学特征的复杂性以及皮肤结构潜在的生理特性，对维持两栖动物的生存、开拓和适应广阔的栖息地以及多样的生态环境中起着重要的作用。

小鲵科动物是亚洲特有的有尾类两栖动物，也是现生有尾目10科中第三大科，全世界现已知66种，隶属2亚科、10属。中国现已知2亚科8属30种，主要分布于东北、西南山区、华中及台湾地区。小鲵科动物生活环境可分为水栖型和陆栖型，由于生活环境导致不同生活环境的小鲵科动物之间皮肤形态结构特征的差异，这些形态特征的差异为小鲵科动物的适应进化研究提供了基础数据；同时小鲵科动物被认为是有尾类中最原始的类群，故皮肤形态结构的研究可为两栖动物的进化研究提供依据。故皮肤形态结构特征在两栖动物中，特别是小鲵科动物中的研究受到众多学者的关注。

要研究皮肤的形态结构特征，皮肤石蜡切片的制作是必不可少的一步。非专利文献《小鲵科动物外部形态特征和皮肤组织的形态学研究》(张向，2014)公开了一种小鲵皮肤石蜡切片制作方法，包括：(1)取材：所采集的小鲵皮肤组织块一般不宜过大，以(3～5mm)×(3～5mm)为宜，固定后流水冲洗24h；(2)脱水：依次放入70％乙醇2h、80％乙醇2h、85％乙醇1h、90％乙醇1h、95％乙醇1h、100％乙醇Ⅰ10min、100％乙醇Ⅱ10min；(3)透明：将脱水后的组织放入正丁醇Ⅰ15min，正丁醇Ⅱ15min进行透明处理；(4)浸蜡：将皮肤组织放入石蜡Ⅰ浸蜡30min，再放入纯石蜡Ⅱ浸蜡2h；(5)包埋：使用75℃左右的石蜡包埋；(6)切片：用单面刀片先将蜡块四周修整平行并切成方形或长方形，把蜡块粘附在木块上，调整刀片与石蜡切片约成5°角，切片厚度为4～6μm；(7)展片、贴片、干燥：将切好的组织片用毛笔卷起，慢慢平摊于44℃的温水中进行展片，然后用载玻片将切片挑起，放入烘烤箱中，烘片以玻片没有明显水渍为准；(8)HE染色：将石蜡切片组织放入二甲苯15min、100％乙醇10min、95％乙醇5min、85％乙醇5min、75％乙醇5min、蒸馏水5min、苏木素10min、流水冲洗5min、1％盐酸酒精分色40s左右、流水冲洗蓝化30min、70％乙醇2min、80％乙醇2min、伊红乙醇5min、95％乙醇4min、100％乙醇4min，再放入二甲苯10min(共计1h58min)，然后用中性树胶封片；(9)封固：在载玻片1/3处滴中性树胶，用右手持细镊轻轻地夹住盖玻片的右侧，并把它的左边放在树胶的左边，然后左手持解剖针扶住盖玻片的左边，右手将镊子松开逐渐下降，慢慢抽出，使树胶在盖玻片均匀地展开并将其中气泡排出，干燥，用二甲苯擦干净盖玻片周围多余溢出的树胶，即得。然而，该方法存在以下不足之处：(1)脱水不完全，造成石蜡渗透不完全，在切片时引起组织出现破碎或空洞，摊片时切片散开，染色时托片和着色不良等；(2)正丁醇脱水效果不佳；(3)浸蜡过程由于缺乏过渡步骤，导致从透明步骤携带的二甲苯进入石蜡中，从而造成石蜡浓度降低，另外浸蜡时间过长造成组织块脆硬。

发明内容

本发明的目的是提供一种小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，该方法可有效去除组织块中的水分，防止石蜡渗透不全；提高透明效果，浸蜡时间相对缩短，可防止组织块脆硬。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：

小鲵科动物皮肤显微组织切片的制备方法，包括以下步骤：

(1)脱水：将经固定处理的小鲵科动物皮肤组织依次浸入浓度梯度50％、70％、80％、90％、95％、100％的乙醇中脱水，其中95％、100％乙醇各重复两次，每个梯度脱水45～60min；

(2)透明：将经脱水皮肤处理的组织浸入100％乙醇与二甲苯的混合液中2～3min，取出后再浸入二甲苯中10～30min；

(3)浸蜡：将经透明处理的皮肤组织放入二甲苯与石蜡的混合液中20～30min，取出后再分两次放入石蜡中，每次45～60min；

(4)将经浸蜡处理的皮肤组织包埋，依次经切片、展片、贴片、烤片、染色、封固处理，即得。