[发明专利]一种深海沉积物来源酯酶EST2及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种深海沉积物来源酯酶Est2、其编码基因及其应用。

背景技术

脂类水解酶(lipolyticenzymes)广泛存在于微生物中，能够催化酯类化合物的水解和合成，根据催化作用方式和底物链的长短可以分为酯酶(esterase，EC3.1.1.1)和脂肪酶(lipase，EC3.1.1.3)。脂类水解酶具有许多优良的特性，例如具有高度手性选择特异性，催化反应不需要辅酶和辅因子，拥有较广的底物谱，在有机溶液中保持高稳定性等，使得脂类水解酶在工业生产中成为重要的催化剂。脂类水解酶可广泛应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理和洗涤工业等方面。目前已经有许多微生物分泌的脂肪酶得到了商业化生产，并应用于生产生活的各个方面。

传统的微生物分离和纯培养方法，是获得微生物及其基因资源的重要基础。然而，因无法再现微生物的原位生境条件等原因，绝大多数微生物难以在实验室获得纯培养。特别是海洋微生物的可培养率不到1％，限制了我们对海洋微生物基因资源的发掘与应用。宏基因组，直接研究环境中的微生物DNA，克服了传统方法的困难，成为了获取海洋微生物基因资源的有力手段，大大开拓了微生物基因资源的来源。目前，宏基因组研究方法已经广泛应用于土壤、淡水、海水、海洋沉积物等环境中。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的深海来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。

本发明从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中，通过特异性底物(三丁酸甘油酯)筛选获得一种新的酯酶基因Est2，经PCR、酶切、克隆和测序，酯酶基因Est2的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。酯酶基因Est2大小为921bp，碱基组成为：136A(14.77％)、135T(14.66％)、383C(41.59％)和267G(28.99％)，编码蛋白大小为306个氨基酸残基，其氨基酸序列如SEQIDNo:2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性最高的酯酶来源于活性污泥的宏基因组，相似性为73％(其在GenBank数据库中的注册号为ADM67447)。系统发育分析结果表明，酯酶Est2属于酯酶家族中的第Ⅳ家族。氨基酸序列分析结果显示，酯酶Est2具有甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的催化结构域(氨基酸位置为142至146)，构成酯酶催化中心，说明Est2属于酯酶第IV家族GDSAG亚家族。综上所述，Est2应为酯酶家族中的一名新成员。

在不影响酯酶Est2蛋白活性前提下，可对SEQIDNO:2所示的远离142-146氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶Est2活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶Est2突变体具有至少与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

同理，本发明还保护对SEQIDNO.1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶Est2蛋白生物学活性的DNA分子。优选的酯酶Est2突变体基因具有至少与SEQIDNO:1所示的核苷酸序列90％以上的同源性，更优选具有至少95％以上的同源性，最优选具有至少99％以上的同源性。

利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶Est2基因连接到合适的载体上，并转化或转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶Est2。合适的原核生物宿主包括各种细菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母(如甲醇酵母)及哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)等，优选采用原核表达系统E.coli。