[发明专利]一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基

说明书

技术领域

本发明涉及一种无血清培养基，属于生化领域。

背景技术

间充质干细胞由于具有良好的自我增殖能力和多向分化潜能，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力。已有的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达，因此可作为组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，在造血干细胞移植和器官移植中也具有广泛的应用前景。

由于存在上述需要，如何大规模的培养和繁殖间充质干细胞是本领域目前关注的热点问题之一。常规的技术方案是在实验室条件下，向培养基中添加胎牛血清使其得到有效培养。这样的培养方式会影响细胞增殖效率及生物学性能，而且存在动物血清质量不佳导致的病毒污染风险，造成细胞制品的异种蛋白污染。

针对以上问题，本领域提出的一种解决方案是在将人间充质干细胞培养到最后1～2代时，将含胎牛血清培养基替换成无血清培养基，但残留的异种蛋白污染始终存在，无法彻底去除；另一种解决方案是全程培养采用无血清培养基，这就要无血清培养基中具有足够的营养物质以维持细胞的良好生长，导致高品质的人间充质干细胞无血清培养基的成本极高，同时一旦营养成分配比设计不合理就会使得干细胞培养失控，使得其难以大规模产业化应用，也难以调控人间充质干细胞制品的品质。

发明内容

针对现有技术的存在的问题，申请人对人间充质干细胞的培养问题进行了深入研究，从而发明了一种无血清培养基，通过改进其中的各组分用量和类型，为人间充质干细胞的生长培养提供充足的营养，同时保证其良好的品质。

具体的说，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种用于培养人间充质干细胞的无血清培养基，以DMEM培养液作为基础培养基，在DMEM培养液中加入有全营养组分：氨基酸、维生素、蛋白营养素、无机盐；调控组分：糖代谢激素、生长因子、抗氧化剂，各成分的用量为在1ml的DMEM培养液中，糖类代谢激素10-20μg、氨基酸120-250μg、生长因子200-500ng、维生素40-100ng、蛋白营养素500-1200ng、抗氧化剂100-180μg、无机盐8-35mg。

通过上述组成，利用全营养组分保证人间充质干细胞的良好成长和繁殖，提供其培养所需各种元素；同时，所添加的调控组分能够对培养的人间充质干细胞增殖速度进行调整，防止过度增长影响所得人间充质干细胞制品的品质。

其中，所用的氨基酸包含细胞生长所需的氨基酸至少包含一种或几种必需氨基酸，和一种或几种半必需氨基酸，以便为其具有良好的活性，且使干细胞在营养平衡状态下进行多代扩增而不发生分化。优选所用氨基酸的组成为必需氨基酸包括苏氨12-15μg、亮氨酸24-30μg、异亮氨酸18-22μg、赖氨酸9-14μg、蛋氨酸30-40μg；半必需氨基酸包括甘氨酸8-14μg、精氨酸9-16μg、丝氨酸30-35μg、酪氨酸28-35μg。

其中，所用的维生素在所给定的浓度范围内能够提高干细胞的增殖能力，与生长因子中间产生协同作用增加生长因子对干细胞的增殖效应。其中，所用维生素优选如下：叶酸20-55ng、d-泛酸钙17-23ng、氯化胆碱3-10ng、维生素B12 3-10ng、肌醇1-5ng。

其中，所用的蛋白营养素能够保持干细胞增殖过程中的活力，优选其组成如下：重组人转铁蛋白15-40ng、腐胺20-25ng、重组人血清白蛋白500-1100ng。

其中，所用的无机盐为干细胞增殖生长提供基本的生存环境，所用无机盐提供干细胞保持其活性所需的离子环境。优选的，所述无机盐包括氯化钙33-40μg、氯化钾70-300μg、氯化钠10-30mg、柠檬酸铁0.8-1μg。在该用量下，提供较为理想的pH环境。

在本发明中，为了实现人间充质干细胞的生长增殖最优化，使用了多种调节成分对其进行微调。下面就各调节成分的作用进行详细说明。

其中，所用的糖类代谢激素以胰岛素为主要成分，辅之以胰岛素反调节激素，胰岛素的用量为12-15μg，胰岛素反调节激素的用量为50-600ng。

在上述中，使用胰岛素能够促进干细胞的生长，刺激干细胞生长过程中的增殖；使用胰岛素反调节激素用来抑制胰岛素的副作用(胰岛素的使用会略微促进干细胞凋亡)。

其中，所用的胰岛素反调节激素可以采用常见的类型，包括但不限于生长激素、皮质醇。