[发明专利]有机介质中生物合成共轭α‑亚麻酸异构体的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

共轭α-亚麻酸是α-亚麻酸的共轭异构体，是一组十八碳共轭三烯酸的统称，有多种位置异构和几何异构体，如：c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸和t10,c12,c15-共轭α-亚麻酸异构体等。研究表明共轭α-亚麻酸具有抗癌、预防动脉粥样硬化、减肥等生理功能，且其生理活性具有异构体特异性，如：c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体具有抗癌的作用。在自然界中，共轭α-亚麻酸主要存在于反刍动物的奶和肉的脂肪中，主要由c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸等异构体构成，但其含量通常十分低，无法满足以保健和医疗为目的的开发应用。

为实现共轭α-亚麻酸的大量制备，人们已对微生物发酵合成共轭α-亚麻酸进行了一些研究。目前，微生物发酵均在水溶液中进行，由于所加的发酵底物—α-亚麻酸是脂溶性物质，因此α-亚麻酸加入发酵液前需经乳化处理，且添加量受到限制，从发酵液中获得共轭α-亚麻酸产物需经有机溶剂萃取，整个生产工艺存在发酵周期长、生产成本高、产量低的缺点。发明专利CN200410060670.9报道了通过干酪乳杆菌CGMCC 1.574来特异性生物合成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体的方法，底物添加量为1mg/mL，发酵时间长达42h，底物的转化率小于50%，且菌体不能重复利用。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提出一种有机介质中生物合成共轭α-亚麻酸异构体的方法，显著缩短合成时间、提高产量和转化率、降低生产成本。

本发明包括以下步骤。

（1）菌体的电穿孔处理：收集处于对数生长期的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574菌体，用脉冲介质洗涤后，将菌体重悬于脉冲介质中（所述脉冲介质为100mM的蔗糖，50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液，体积百分比0.1%的吐温-80），菌体浓度为1×10⁹cfu/mL，冰浴10min，经电场强度为10kV/cm、脉冲宽度为20μs的脉冲电场处理10次，每次间隔时间为2s，处理后离心收集菌体。

（2）菌体包衣处理：菌体用50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液洗涤后，离心收集菌体，按每克湿菌体重悬于20mL50mM、pH5.8的磷酸盐缓冲液中计，将湿菌体重悬于磷酸盐缓冲液中，加入菌悬液体积百分比0.5-2.0%的吐温-80混合均匀，于4-40℃处理2-6h，离心收集菌体，将菌体冷冻干燥后得到包衣菌体。

（3）有机介质中生物合成：按每克包衣菌体加入到600mL正己烷中计，将包衣菌体加入到正己烷中，搅拌均匀，加入正己烷体积百分比0.1-0.3%的α-亚麻酸，在4-40℃下反应1-12h。

（4）产物收集：离心分离包衣菌体，将正己烷溶液进行减压蒸馏，回收正己烷，产物为c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体。

本发明所述的步骤（2）中吐温-80的加入量优选为菌悬液体积百分比的0.75-1.5%。

本发明所述的步骤（2）中处理温度优选为4-25℃。

本发明所述的步骤（2）中处理时间优选为3-5h。

本发明所述的步骤（3）中优选加入正己烷体积百分比0.125-0.25%的α-亚麻酸，在15-30℃下反应2-6h。

本发明所述的步骤（4）中包衣菌体可重复用于有机介质中生物合成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体。

本发明所用的干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）CGMCC 1.574，系中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏菌株，编号为1.574，该菌株能产生特异性的亚油酸异构酶，能将多不饱和脂肪酸中的c9,c12双键异构成c9,t11共轭双键，通过生物异构化可将α-亚麻酸转化成c9,t11,c15-共轭α-亚麻酸异构体。目前，还没有从该菌中分离到有确切催化活性的异构酶纯品。因此，该异构化反应可能是由多酶体系共同催化完成。