[发明专利]一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法

说明书

技术领域

本发明一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法，属于材料、生物和分析化学交叉学科的技术领域。

背景技术

胰蛋白酶是蛋白质分解中最重要的消化酶之一，胰蛋白酶原的分泌、活化、抑制以及循环的不平衡会导致急性或慢性的胰腺疾病，严重的例如胰腺癌。大约每年有35000例胰腺癌是由于丝氨酸蛋白酶尤其是胰蛋白酶的不平衡引起的。此外胰蛋白酶不仅起消化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前体，起活化作用。

目前发展起来的测定胰蛋白酶的方法主要有紫外分光光度法、比色法、荧光法、免疫法、质谱法(MS)、液相色谱法(HPLC)、电泳法等。紫外分光光度法与比色法操作简单，但灵敏度低，重现性差。免疫法灵敏度高，如专利201020245770.x所述，但由于单克隆抗体的使用使得成本也高，且需要一定的操作技术。质谱仪器昂贵，对样品的纯度要求高，色谱以及电泳法需要比较复杂的操作和较长的检测时间。

相比这些方法，荧光法操作简便、灵敏度高、可实现实时监测，具有临床应用的潜在可能。目前报道的荧光检测的方法主要是应用水溶性荧光共轭聚合物以及新型的聚集诱导发光分子或者荧光量子点，荧光共轭聚合物与聚集诱导发光分子的合成与分离仍然比较复杂，提高了成本，量子点则可能具有一定的毒性。因而建立检测过程简单、成本低、生物相容性良好的荧光检测方法具有重要的意义。

芘是一种常用的疏水染料，它的量子产率高，有规整的苯环结构，对环境的亲疏水性非常敏感，广泛用于检测聚合物的临界胶束浓度(CMC)以及检测DNA，小分子等。但由于其疏水性，限制了它在水溶液中的广泛应用。研究者们发现，将芘结合在亲水性聚合物上可以有效增溶芘，基于芘修饰的聚合物在生物监测方面的报道还很少。通过检索，未见芘修饰的聚合物荧光检测胰蛋白酶的方法。

发明内容

本发明一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法的目的是克服现有技术的不足，提供一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法。

本发明一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于是一种由荧光标记聚合物与吸附在荧光标记聚合物表面的细胞色素C组成的复合物水溶液，复合物水溶液的重量百分浓度为0.0005％～0.05％。

上述一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于所述的荧光标记聚合物为芘封端的聚环氧乙烷或芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱，荧光标记聚合物的数均相对分子质量为8000～13000，化学结构式为：

其中n₁＝175-290，n₂＝25–45。

上述一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针，其特征在于所述的细胞色素C为市售纯度高于95％，来源于猪心、马心或牛心的细胞色素C。

上述一种用于胰蛋白酶检测的荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)将荧光标记聚合物溶于浓度为10～100mM，pH＝7.4～9.0的磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,制成重量百分比浓度为0.0002～0.01％的水溶液A；

(2)将细胞色素C溶于浓度为10～100mM，pH＝7.4～9.0的磷酸盐或三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液中,制成重量百分比浓度为0.0008～0.1％的水溶液B；

(3)将水溶液A与水溶液B等体积混合，反应5～60分钟，让细胞色素C吸附在荧光标记聚合物表面，获得检测胰蛋白酶的荧光探针。

用于胰蛋白酶检测的荧光探针及其制备方法一种本发明与现有技术相比具有的有益效果：

(1)采用水溶性聚合物增溶芘，使疏水性染料芘能应用于亲水环境监测，扩大了芘的应用范围，降低了成本；

(2)芘修饰的水溶性聚合物稳定性好、生物相容性好，检测过程简单灵敏，检测胰蛋白酶特异性好，具有很强的实用性。

附图说明

图1是荧光探针(芘封端的聚环氧乙烷加入细胞色素C)以及在荧光探针中加入不同浓度胰蛋白酶的荧光光谱图。

图2是芘封端的聚2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱与疏水性染料芘自身的荧光光谱图。

具体实施方式

本发明通过对疏水性染料芘进行亲水性聚合物修饰，所获得的水溶性两亲荧光标记聚合物作为荧光发射的能量给体，细胞色素C作为胰蛋白酶的底物，通过细胞色素C在荧光标记聚合物表面的吸附，得到胰蛋白酶检测的荧光探针。加入对细胞色素C有水解作用的胰蛋白酶，水解得到的血红素作为吸收荧光的能量受体，通过荧光强度的降低来实现酶活性的检测。

实施方式1：