[发明专利]一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法

权利要求书

1.一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括烟叶表面消毒、切片培养、菌丝的分离纯化、菌丝DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS-rDNA基因、PCR目的片段的测序、序列的比对鉴定，具体步骤如下：

（1）用无菌水浸泡新鲜烟叶并洗涤，除去烟叶表面杂质；

（2）将步骤1中处理烟叶用75%乙醇浸泡消毒2～3 min，并用无菌水洗涤2～3次除去乙醇；

（3）检验步骤（2）中消毒是否彻底：取最后一次清洗烟叶上乙醇的无菌水，利用涂布法涂平板培养，看是否有杂菌长出，若有无杂菌长出则消毒彻底；若有杂菌长出，则消毒不彻底，需重复消毒；

（4）将步骤（2）中烟叶去除叶片边缘，切成0.5×0.5 cm小块放入培养基中培养；

（5）将步骤（4）中的烟叶与培养基放入培养箱，25℃恒温培养；

（6）观察步骤（5）中烟草内生菌生长状态，待切口处长出菌丝后，将菌丝在新鲜培养基中利用平板划线法进一步纯化，连续分离3～5次即可得到表面形态一致的烟草内生真菌；

（7）观察记录步骤（6）中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号，将一部分纯化的菌丝在无菌条件下利用接种针挑入已灭菌的20%甘油水溶液中，-20℃保存留种；另一部分冷冻干燥后备用；

（8）取 0.1 g步骤（7）中冷冻干燥后的菌丝放入预先加入液氮的研钵中，充分研磨，再转移到1.5 mL Eppendorf管中，加入0.1 mL 10%的SDS、0.3 mL氯化苄，剧烈振荡使之成乳状；

（9）在50℃水浴锅中保温1 h，每隔10 min振荡混合1次；

（10）加入0.3 mL 3 mol/L pH 5.2的 NaAc，冰水浴15 min，4℃下12000 r/min离心10 min，取上清液至一个已灭菌的新Eppendorf管中；

（11）加入等体积的氯仿-异戊醇和苯酚，其中氯仿-异戊醇和苯酚体积各半，振荡摇匀；4℃下12000 r/min离心10 min，取上清至另一个已灭菌的新Eppendorf管中，所述氯仿-异戊醇的比例为24:1；

（12）重复步骤（11），然后加入1/10体积的3 mol/L NaAC和等体积的预冷的异丙醇，轻轻上下混匀，可见有絮状沉淀析出，置入-20℃冰箱15～17 h，使DNA充分沉淀；

（13）4℃下12000 r/min离心10 min，收集沉淀，加入75%预冷的乙醇洗涤沉淀两次；

（14）吸除乙醇，在通风橱中干燥10～15 min，加入30～50 μL TE缓冲液溶解DNA，-20℃保存备用；

（15）检测DNA的纯度和浓度；

（16）以提取的DNA为模板，PCR扩增真菌的ITS-rDNA基因；

如果PCR扩增出特异性目的条带，将该目的条带胶回收，与T载体连接，转化感受态细胞，随机挑取单克隆进行测序；

（17）将所测序列在NCBI上进行Blast序列比对，对烟草内生真菌进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，其特征在于：步骤（4）中的培养基组成为：葡萄糖40 g/L, 蛋白胨10 g/L，酵母粉10 g/L，琼脂15～20 g/L，20～30万单位/L的青霉素。

3.根据权利要求1所述的快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，其特征在于：在步骤（15）中，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测DNA的纯度和浓度。

4.根据权利要求1所述的快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，其特征在于：步骤（16）中的PCR反应体系如下，以50 μL反应体系为例：

反应物体积终浓度DNA模板Variable As required10× PCR BufferⅠ5 μL1×2.5 mmol/L dNTPs4 μL0.2 mmol/LHiFi酶0.5～1 μL2.5～5 units上游引物（10 μmol/L）1～2 μL0.2～0.4 μmol/L下游引物（10 μmol/L）1～2 μL0.2～0.4 μmol/LddH₂OVariable—总体积50 μL—

PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸45 s，共运行30～35个循环；最后72℃延伸10 min；4℃保存。