[发明专利]调控基因dasR对红色糖多孢菌次级代谢产物合成方法及其应用

说明书

本发明涉及dasR基因对红霉素生产菌红色糖多孢菌在影响次级代谢产物合成方法及其应用；该方法包括如下步骤：敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因，得到突变工程菌；所述dasR基因的核苷酸序列为序列表中的序列。所述敲除dasR基因的得到的突变株或所述的突变株在影响次级代谢物产量中的应用，所述次级代谢物具体为红霉素和红棕色色素。与未敲除的野生型菌株相比，dasR基因敲除工程菌株产生红霉素和色素的量减少。说明该基因与次级代谢物的产生正相关。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，主要涉及dasR基因对红霉素生产菌红色糖多孢菌在影响次级代谢产物合成方法及其应用。

背景技术

红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea)是一种革兰氏阳性丝状细菌，它最初被认为属于链霉菌属，曾一度被称为“红色链霉菌”(Streptomyces erythraeus)，但是后来进一步研究发现它其实是属于糖多孢菌属。

红色糖多孢菌是红霉素主要生产菌，而红霉素主要用于杀死革兰氏阳性致病菌。这种大环内酯类的广谱抗生素自J.M.McGurie最初发现至今已逾六十年历史。然而红霉素因其高效的治疗效果和使用的安全性至今仍然在医药界广泛应用。此后，人们对红霉素A的分子结构进行改造并由此演变出丰富多样更加有效的衍生物。这些半合成的第二代衍生物比如克拉霉素(Clarithromycin)和阿奇霉素(Azithromycin)和第三代衍生物酮内酯类抗菌药(ABT-773和HMR-3647)不仅具有更好的疗效作用，也增加了红霉素A作为初始原料的使用需求，从而推动了整个红霉素在医药市场的发展。

在早期，由于技术落后导致基因组序列信息的匮乏，使人们对于一些产抗生素放线菌的改造主要基于对野生菌的多轮的随机诱变，进而大量筛选得到高产的突变菌株，这种近乎暗箱操作的菌株优化方法不仅耗时耗力且往往效率低下。随着测序技术的进步，2007年剑桥大学的研究者们完成了对红色糖多孢菌野生株(S.erythraea NRRL23338)全基因组的测序工作，从而使人们对这个重要的工业放线菌的分子改造变得更加有的放矢。

通过基因工程改造红色糖多孢菌以提高红霉素产量有两个策略：一是在对红霉素合成生化途径的了解的基础上，通过理性改造红霉素合成前体甲基丙二酰辅酶A(Methylmalonyl-CoA)的代谢流，二是在体内高表达调控红霉素合成基因簇的调控基因。而后者直接提出了对于抗生素合成调控相关基因的研究的紧迫性，这也是目前对于放线菌领域研究的重要部分。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过缺失红色糖多孢菌dasR基因影响次级代谢物产量的方法及其应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种调控基因dasR对红色糖多孢菌次级代谢产物合成方法，包括如下步骤：敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因，得到突变工程菌；

所述dasR基因的核苷酸序列为序列表中的序列。

上述方法中，所述敲除红色糖多孢菌基因组中的dasR基因是通过双交换同源重组基因敲除的方法，包括如下步骤：

1)在敲除质粒pUC18-tsr的抗性基因tsr上下游接入预敲除基因dasR的上下约1500bp的同源臂序列，得到dasR基因缺失的pUC18-dasR质粒；

2)将dasR基因缺失的质粒通过原生质体转化方法导入到预先制备的红色糖多孢菌野生株原生质体中，得到dasR基因缺失的突变工程菌；

3)在含硫链丝菌肽抗性平板上筛选突变工程菌，并通过PCR和测序的方法验证突变菌。

所述红色糖多孢菌为红色糖多孢菌野生株NRRL23338。

本发明还提出了一种敲除dasR基因的得到的突变株或上述的突变株在影响次级代谢物产量中的应用。