[发明专利]Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法

说明书

技术领域

本发明属于医学研究领域，尤其涉及一种Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法。

背景技术

机体氧化和抗氧化失衡所导致的氧化损伤是衰老和疾病发生的核心机制。已经证实，包括急性冠脉综合征、糖尿病、肝硬化以及中毒等急慢性疾病的发生均与氧化损伤有关。有鉴于此，内外许多学者试图采用补充超氧化物歧化酶(SOD)、维生素C、维生素E、谷光甘肽、退黑素等抗氧化物治疗氧化性损伤。然而，外源性抗氧化物分子量大，较难透过细胞膜进入细胞内，且迅速被代谢，所以无法真正有效的纠正细胞内氧化-抗氧化失衡状态，其对机体氧化性损伤的治疗亦达不到预期效果。

核因子E2相关因子2转录因子(nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2)属于Cap′n′Collar家族，是调节细胞内众多抗氧化物表达的关键性因子。生理条件下，Nrf2在细胞质中与Keap1结合处于非活化、易降解的状态。在氧化应激原作用后(如毒物、吸烟、损伤等)，Nrf2转录因子与Keap1解离活化进入细胞核，并与抗氧化反应元件ARE(antioxidant response element)结合，启动下游的II相解毒酶、抗氧化蛋白等基因转录和表达，增加细胞对氧化损伤的抗性。Mercado等研究发现，去乙酰化酶抑制剂能够显著抑制氧化应激后Nrf2蛋白表达和活性，下游抗氧化分子的表降低，提示去乙酰化在维持Nrf2蛋白的稳定性和活性中起着重要的作用。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1，Sirt1)是NAD依赖的去乙酰化酶，可以与转录因子及转录因子共调节因子相互作用，通过去乙酰化作用调节靶蛋白活性、基因转录。有鉴于此，深入了解氧化应激情况下Nrf2乙酰化状态，分析Sirt1-Nrf2抗氧化效应，对于氧化损伤相关疾病的治疗具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法，旨在深入了解氧化应激情况下Nrf2乙酰化状态，分析Sirt1-Nrf2抗氧化效应。

本发明是这样实现的，一种Sirt1-Nrf2新抗氧化通路在氧化损伤治疗中应用的实验方法包括体外实验和体内试验；

所述的体外实验包括：

步骤一、小鼠AEC-II的分离纯化；

步骤二、小鼠肺泡II型上皮细胞的鉴定；

步骤三、RT-PCR检测PQ暴露小鼠AEC-II中Sirt1、Nrf2基因表达改变与PQ作用的时间、剂量效应关系；

步骤四、Western-bolt法检测PQ暴露小鼠AEC-II中Sirt1、Nrf2蛋白表达改变与PQ作用的时间、剂量效应关系；

步骤五、免疫沉淀法检测PQ暴露小鼠AEC-IINrf2的乙酰化水平；

步骤六、化学比色法检测SOD、CAT、GSH、MDA；

步骤七、ELISA检测HO-1表达；

步骤八、CO-IP法检测Sirt1与Nrf2蛋白之间的相互作用；

所述的体内实验包括：

步骤一、小鼠原代MSC提取与培养；

步骤二、BMSC的免疫荧光鉴定；

步骤三、慢病毒转染BMSC细胞；

步骤四、PQ中毒小鼠实验分组及模型建立；

步骤五、PRC法、Western-blot法检测Nrf2、Sirt1蛋白的表达情况；

步骤六、化学比色法检测MDA、SOD、GSH、CAT改变；

步骤七、ELISA法检测IL-1β、TNF-α、IL-10、TGF-β1蛋白含量；

步骤八、肺组织损伤的检测。

进一步，所述的RT-PCR检测PQ暴露小鼠AEC-II中Sirt1、Nrf2基因表达改变与PQ作用的时间、剂量效应关系中的PCR引物为：

Sirt1，上游序列为5’-acgctgtggcagattgttatta-3’，下游序列为5’-ttgaagaatggtcttgggtctt-3’；

Nrf2，上游序列为5’-attctttcagcagcatcctctc-3’，下游序列为5’-acacttccaggggcactatcta-3’；

β-actin，上游序列为5’-atatcgctgcgctggtcgtc-3’，下游序列为5’-aggatggcgtgagggagagc-3’。