[发明专利]采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于组织工程产品制备技术领域，具体涉及一种采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的方法及应用。

背景技术

肝移植是治疗晚期肝病的有效方法之一，但缺乏供体来源、手术费用昂贵及术后终生使用免疫抑制剂等诸多问题制约了该项技术的临床应用。因此，干细胞通过培养、诱导、分化为肝细胞样细胞用于细胞移植、或作为生物工程化的类肝器官的种子细胞，为肝病的治疗提供了新的治疗方法与技术，也为药物代谢与毒性试验提供了新的方法与技术。然而，供区短缺、采集困难等严重限制了细胞的获取，对于供区细胞的储存和活性维持的适当的细胞培养方案的缺乏等对该项技术的应用也构成了明显的障碍。

利用取自人自体小涎腺的上皮干/祖细胞，在体外培养诱导分化为肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞，具有来源广泛、取材方便、创伤微小、供区隐蔽等优点，该干细胞生长特性好，可以在体外长期大量扩增，可以满足临床上细胞使用量多的需要。除可用于体内移植治疗肝病外，还可作为体外生物工程化的类肝器官的构建、体外肝病模型的构建，药物试验、毒性试验与肝脏功能研究等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的方法及应用。

一种采用人小涎腺上皮干/祖细胞制备肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞的方法，按照如下步骤进行：

(1)制备人小涎腺上皮干/祖细胞：

a)预处理人小涎腺组织；

b)在角质细胞培养基中贴壁培养预处理后的人小涎腺组织，培养分离出小涎腺上皮干/祖细胞。

角质细胞培养基：DMEM/F12添加BSA(牛血清白蛋白)5μg/mL，transferrin(转铁蛋白)5μg/mL，BPE(牛垂体提取物)50μg/mL，insulin(胰岛素)3.75g/mL，FGF-23ng/mL，EGF1ng/mL，epinephrine(肾上腺素)500ng/mL，hydrocortisone(氢化可的松)0.5g/mL，ProstaglandinE2(前列腺素E2)10^-8MandT330nM，100U/ml青/链霉素。

C)小涎腺上皮干/祖细胞在上皮细胞培养基中进一培养扩增。

上皮细胞培养基：在角质细胞培养基中添加了3μMCHIR、0.5μMA83、为了预防细胞凋亡，在每次传代后第12或24小时内添加0.5μMThiazovivin。

(2)人小涎腺上皮干/祖细胞诱导分化为肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞，接种人小涎腺上皮干/祖细胞于平面培养体系或3D培养体系中，添加含有生长因子的上皮干细胞成肝诱导培养基，每三天换液，经过21天诱导培养后获得肝细胞样细胞和胆管细胞样细胞。

成肝细胞诱导培养基，在角质细胞培养基中中添加有：20ngml^-1OSM，0.5mMA83，0.1mMC-E，20ng/ml的HGF，10ng/ml的IGF，100nM的地塞米松，10mmol/L的尼克酰胺。

所述上皮干细胞成肝诱导培养基中还可以加入100mmol/L的苹果酸，加入后，可缩短诱导时间。

所述预处理人小涎腺组织的步骤为：

将小涎腺组织转移到培养皿中，用小剪刀去除多余的结缔组织，分离得到完整的小涎腺，吸去培养皿中的全部液体，用眼科剪将其剪成大约1mm³的碎块。

所述预处理切取小涎腺组织的过程中，将组织转移到培养皿中后，还可以向培养皿中加入小蓟提取物培养液，浸泡10min，用小剪刀去除多余的结缔组织，分离得到完整的小涎腺，吸去培养皿中的全部液体，用眼科剪将其剪成大约1mm³的碎块。这样处理后的小涎腺组织在后续贴壁培养过程中，能缩短培养时间。

所述的小蓟提取物培养液采用如下方法制备：将小蓟晒干，磨成粉末，过200筛，然后加5倍重量的70％乙醇溶液回流提取3次，合并滤液，活性炭脱色，蒸干，得到白色粉末状物质，采用去离子水配置成质量分数1％的溶液，制成小蓟提取物培养液。

所述贴壁培养预处理后的人小涎腺组织的步骤为：

用小镊子将人小涎腺组织碎块均匀的铺于培养瓶底部，间距平均5mm，加好培养基后竖立放于培养箱中，添加5ml角质细胞培养基，6至8小时后放倒培养瓶，使组织块完全浸在培养液中，三天后首次观察，弃去未贴壁的组织块和液体，重新加入5ml角质细胞培养基，以后每3天换液一次。