[发明专利]一种油茶子叶节直接再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，是一种以油茶子叶节直接再生植株的方法。

背景技术

油茶(Camellia Oleifera)是山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)常绿灌木或小乔木，是我国特有的木本食用油料树种，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物。茶油不饱和脂肪酸含量达90％以上，色佳味香，风味独特，营养丰富，耐贮藏，有降血压、血脂及软化血管的作用，对心血管疾病的预防有重要作用，是优质的食用油之一，被誉为“东方橄榄油”。同时，油茶副产物还是生产肥料、农药、栲胶的优质原料。目前，中国共有油茶林4531.2万亩，年产茶油20多万吨，平均亩产茶油5.8kg，油茶产业普遍存在着单位面积产量低和经济效益差两大问题。油茶低产低效的重要原因之一就是良种化程度低，品种混乱，大部分油茶林处于野生状态，产量较低，良种苗木短缺不能大面积推广种植。同时，油茶炭疽病Glomerella cingulata(Stonem.)Spauld et Schrenk是油茶的主要病害。在长江流域以南各省的大面积油茶栽培区，以及河南、陕西南部地区发生普遍。病害发生后，引起严重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡，严重影响了油茶产业的健康发展。通过组织培养可以快速繁殖油茶脱毒苗，在此基础上通过遗传体系转化而获得抗病植株，在木本油料植物遗传改良方面有广阔的前景。

组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，具有广阔的商业化前景。关于油茶组织培养的研究较多，张智俊等人利用油茶无性系子叶通过体细胞胚胎发生途径获得了再生植株，李泽等人利用油茶带芽茎段获得再生植株，但以上研究只能在油茶组织培养快繁方面有重要意义，不能应用到油茶遗传体系转化获得转基因植株。植物遗传体系转化最常用的方法是农杆菌介导法侵染植物叶片、下胚轴、叶柄、子叶节、胚根等器官，而油茶叶片诱导不定芽的诱导率仅为17.86％，目前还不能应用在油茶遗传体系转化方面，油茶转基因至今还未找到合适的外植体。子叶节具有较高的分化能力，目前，科研工作者已经在西瓜、黄瓜及大豆等植物中通过子叶节直接诱导不定芽获得了再生植株，并且通过农杆菌侵染大豆子叶节获得了转基因植株。油茶子叶节直接获得再生植株的研究还未见报道，本发明通过利用油茶子叶节直接诱导不定芽，旨在建立一个高效、简便、稳定的繁殖体系，为油茶快速繁殖及工厂化育苗奠定基础，也为油茶的转基因研究提供一种技术手段。

发明内容

本发明的目的是针对目前油茶采用叶盘法获得再生植株技术还未建立，在此基础上，提供了利用油茶子叶节通过器官发生途径获得再生植株的方法，该方法利用油茶子叶节直接诱导不定芽，其诱导率高，不定芽健壮，继代增殖系数高，壮苗效果好，生根率高，关键还在于能够通过农杆菌浸染实现油茶遗传转化的可能性。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

一种油茶子叶节直接再生植株的方法，包括以下步骤：

1)诱导不定芽：在无菌条件下切取0.5cm²的小块油茶膨大的子叶节(子叶节即下胚轴连接子叶的部分)，接种到培养基为1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0-0.5mg/L IAA+2.0mg/L GA₃诱导不定芽；

2)继代培养：将诱导的不定芽切下接种到1/2MS+2.0-3.0mg/L 6-BA+0.05-0.1mg/L IBA+0-1.0mg/L GA₃的培养基中进行不定芽的继代增殖培养；

3)壮苗培养：将增殖培养得到的芽转接到WPM+0.5mg/L NAA+3.0-5.0mg/L GA₃的培养基中进行壮苗培养；

4)生根培养；

5)炼苗、移栽。

上述方法中诱导不定芽时暗培养2d后，再到光照条件下培养20-25d。

上述方法中继代增殖培养时暗培养3d，再到光照条件下培养20-30d。

上述方法中壮苗培养时暗培养2d，再转到光照条件下培养20-25d。

上述方法中将壮苗培养获得3-4cm的苗接到1/2MS+1.0-2.0mg/L IBA+1.0-2.0mg/L NAA+35g/L珍珠岩的培养基中进行生根培养；

上述方法中生根培养时暗培养5d，再转到光照下培养20d即生根。