[发明专利]基于三维细胞培养的3D细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种细胞遗传检测的技术领域，尤其涉及的是一种基于三维细胞培养的3D细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法。

背景技术

A_L细胞是人成纤维细胞与中国仓鼠卵巢细胞(CHO)杂交后所得到的永生化细胞，包含一条单拷贝的人11号染色体和整套中国仓鼠染色体。该细胞作为一种遗传毒性检测体系对诱变剂种类没有选择特异性，且相比于其他突变检测体系更加灵敏(Hei TK,Piao CQ,He ZY,Vannais D,Waldren CA.Chrysotile fiber is a strong mutagen in mammalian cells[J].Cancer Res,1992,52(22):6305-6309)。然而，该遗传毒性检测体系是在二维(2D)培养条件下进行实验，难以准确反映诱变剂对体内细胞突变的影响。

随着细胞培养技术的发展，研究发现由于体外培养条件与体内环境差异较大，细胞在体外培养时，形态和功能会发生一定程度的改变，导致以2D细胞培养为基础的药物或生物学研究出现偏差，并且难以预测细胞在体内的真实活动信息。为了减少这种差异性，三维(3D)细胞培养技术得以提出。使用这种培养技术可以让细胞聚集生长，形成组织样结构，这样有助于细胞之间紧密连接，促进细胞间的信息交流，可以为研究提供更真实的细胞信息。

判断3D细胞的构建情况，可通过检测细胞团形态、数目、直径、干性相关基因的表达量来确定。其中检测细胞干性相关基因是由于多能干细胞倾向于形成团块或集落形态，并且细胞团块的形成可能与细胞干性有关，相关研究也证明了这点。例如，悬浮培养的神经祖细胞(NPCs)会形成神经球，培养成细胞团状的间充质干细胞(MSC)能够保持干性标记基因的表达。而3D细胞在培养期间会聚集成团，影响有关细胞干性相关基因(Nanog、Oct4、Klf4、Sox2、Lin28等)的表达，因此通过检测细胞干性相关基因，可以帮助判断3D细胞的构建情况。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种基于三维细胞培养的3D细胞培养基及其建立遗传毒性检测体系的方法，以解决二维(2D)培养条件下，细胞的形态和功能会发生一定程度的改变，导致以2D细胞培养为基础的药物或生物学研究出现偏差，并且难以预测细胞在体内的真实活动信息。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于三维细胞培养的3D细胞培养基，所述3D培养基为由预热的无菌的2×Ham’s F12培养液与预热的无菌的质量比为1％的琼脂糖溶液按照1：1体积比混合制成。

一种利用上述的基于三维细胞培养的3D细胞培养基建立遗传毒性检测体系的方法，包括以下步骤：

(1)制备3D细胞培养基

将预热的无菌的2×Ham’s F12培养液与预热的无菌的质量比为1％的琼脂糖溶液按照1：1体积比混合，铺在培养皿中，待冷却后，获得胶状Ham’s F12培养基，即为3D细胞培养基；

(2)A_L3D细胞的培养

步骤一、将A_L细胞接种于3D细胞培养基中，置于CO₂细胞培养箱中培养；

步骤二、每2天换液一次，具体步骤为：将培养的A_L细胞离心，去上清，加入新鲜的无菌的Ham’s F12完全培养液混匀，重新接种在3D细胞培养基上；

步骤三、培养若干天后，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。

所述步骤(1)中，胶状Ham’s F12培养基在培养皿中的铺设厚度为4mm。

所述步骤一中，A_L细胞的接种量为3×10⁶个。

所述步骤一中，置于CO₂细胞培养箱中培养的条件为：37℃，CO₂含量为5％体积比。

所述步骤二中，A_L细胞离心的条件为：1000g下离心3min。

所述步骤三中，培养5～7天，获得3D细胞的遗传毒性检测体系。

所述基于三维细胞的遗传毒性检测体系的建立方法中，所述步骤(2)之后还包括步骤(3)3D细胞的遗传毒性检测体系的检测步骤，所述检测步骤包括3D细胞特性指标检测和体系灵敏性检测。

所述3D细胞特性指标检测包括3D细胞形态、直径、细胞数、细胞活性、本底基因突变率和基因表达量检测，所述体系灵敏性检测包括诱变剂处理的基因突变率检测。