[发明专利]一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体地涉及一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günter)是我国第一种进行人工养殖的舌鳎科鱼类，俗称牛舌头、鳎目、鳎米、龙利，属鲽形目Pleuronectiformes、舌鳎科Cynoglossidae，自然分布于我国沿海海区，以渤海、黄海为多，栖息于泥沙质海底，是一种名贵的底栖大型鱼类，目前，由于具有良好的市场经济价值，有“富贵鱼”、“海洋中的黄金”之称。但是半滑舌鳎的摄食习性非常特殊,习惯夜间摄食，对颗粒饲料采取底匍摄食,明显不同于鲆鲽类养殖品种牙鲆和大菱鲆等采取投喂后主动从池底跃起摄食的习性。这种特殊的摄食行为,使人工养殖条件下的投喂非常困难,摄食差、死亡率高并表现出生长缓慢现象,这已成为制约半滑舌鳎推广养殖的瓶颈。因此,探索半滑舌鳎的摄食行为,对于促进其摄食以及为其他鳎科鱼类的养殖开发提供借鉴,都具有重要的理论意义和经济意义。近年来，半滑舌鳎摄食行为和感觉生理成为研究热点。前期研究表明半滑舌鳎的侧线系统在摄食行为中起主导作用。半滑舌鳎的侧线系统是由覆盖在有眼侧皮肤的管道神经丘和只分布在无眼侧头部皮肤的游离神经丘两部分组成，而半滑舌鳎的活体皮肤具有管道神经丘以及游离神经丘，是从分子水平探索半滑舌鳎摄食行为和感觉生理的重要实验材料。

目前，很多研究都针对改良RNA的提取方法，对前处理方法涉及很少，有关半滑舌鳎皮肤组织的获取的探索研究更是少之又少。研究发现半滑舌鳎皮肤黏液腺发达，各黏液腺通过黏液分泌管相互连结，并通过无数个开孔通向皮肤表面，致使鱼体半滑舌鳎皮肤表面覆盖厚厚的粘液，同时肌肉剥离困难，易混入肌肉中的RNA，因此要从半滑舌鳎鱼体中获取单一皮肤组织存在很多困难，。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，该方法所需费用极低，材料易得，操作简便，效果显著。利用本方法可快速、高效的获得半滑舌鳎皮肤组织，用于获取高质量的皮肤RNA；为半滑舌鳎皮肤功能基因的相关研究提供了重要且可靠的分子实验材料。

一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，包括以下步骤

(1)首先用1×PBS缓冲液清洗鱼体表面，去皮肤表面覆盖的粘液；

(2)在选取的皮肤部位，利用解剖刀切入深度为1.8-3.0mm方块，所述方块面积大约为0.25-4cm²，且不要脱离鱼体；

(3)利用移液枪向步骤(2)中1.8-3.0mm深的方块四周裂口处注满4％多聚甲醛溶液，固定处理1min-4min；

(4)然后吸取4％(g/100ml)多聚甲醛溶液滴加到所处理的方块皮肤表面，固定处理30s-1min；

(5)选取方块的一角，用镊子直接撕取该组织块表面皮肤，获取的皮肤组织能够直接用于RNA的提取或冷冻保存。

本发明与现有技术相比的有益效果：

1、本发明所需材料主要是1×PBS缓冲液和4％多聚甲醛溶液，材料易获取，需用量极少，费用较低。

2、本发明首次利用固定液的固定特性，第一能够有效去除半滑舌鳎皮肤表面的粘液蛋白，并减少其分泌；第二能够使肌肉组织固定变硬，致使皮肤组织与肌肉组织剥离，可以干净快速获取半滑舌鳎单一皮肤组织。与常规方法相比一方面能够简易快速获得皮肤组织，而且有效减少了粘液蛋白含量，能够显著降低了皮肤RNA降解；另一方面皮肤中不会残留肌肉组织，能够得到更纯的皮肤RNA，获得更可靠的后续实验结果。

3、本发明首次利用4％(g/100ml)多聚甲醛溶液能够更好的保存RNA完整性的特性，短时间内基本不会破坏RNA的完整性，能够获得高质量的RNA。

附图说明

图1：本发明方法提取的RNA电泳图。

图2：本发明方法与常规方法获取半滑舌鳎皮肤组织提取RNA比对效果图：1，、2，、3、4代表常规方法提取的RNA；5和6代表本发明方法提取的RNA。

具体实施方式

下面通过实施例来对本发明的技术方案作进一步的改进，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例

一种半滑舌鳎皮肤组织RNA提取的前处理方法，具体方法如下(本实验所需试剂和耗材均需RNA-free，所用的鱼为刚刚死亡的半滑舌鳎，体长37cm，体重750g)；

(1)首先用1×PBS缓冲液清洗鱼体表面，此步骤尽量除去皮肤表面覆盖的粘液；