[发明专利]一种测定等离子体杀菌后悬浮液中蛋白质含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于消毒技术领域，特别是提供了一种测定等离子体杀菌后悬浮液中蛋白质含量的方法。

背景技术

等离子体会对细菌表面有刻蚀作用，这种刻蚀作用会导致细胞膜结构破坏，例如细胞膜上的脂蛋白和脂质淀粉酶逸出等，最终造成细胞膜裂解、胞内物质释放而导致细菌死亡。因此，等离子体杀菌后悬浮液中细菌蛋白质泄漏量能够反映出等离子体的杀菌效果以及细菌破裂程度，但目前国内外对等离子体杀菌后悬浮液中细菌蛋白质含量的研究甚少。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出一种测定等离子体杀菌后悬浮液中蛋白质含量的方法。

本发明为达到以上目的，是通过以下的技术方案来实现的，包括的步骤如下：

(1)、配制A、B、C、D、E五种试剂；

A：143mM NaOH与270mM Na₂CO₃

B：57mM CuSO₄

C：124mM Na₂-Tartat

D：A，B，C分别按照98∶1∶1混合

E：Folin-Cioucalteu试剂

(2)牛血清白蛋白标准曲线的制定，精确称取的0.0100g结晶牛血清蛋白倒入烧杯中，加蒸馏水溶解后转到100ml容量瓶中定容得到；然后取编号为1-6的试管6只，配置不同浓度的蛋白质标准含量溶液，实验中取每种样品3ml至干净的试管中，然后加试剂D 4.2ml，使用漩涡振荡器混合10s后室温下放置10min，然后在所有试管中均加入试剂E 0.6ml，立即混合均匀；计时45min以后，将1号试管作为不含蛋白质的对照组，使用分光光度计在750nm波长下测定所有样品的吸光度结果并记录；然后根据所得结果就能得到蛋白质含量的标准曲线，以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线；

(3)待测液中蛋白质泄露含量的测定，等离子体杀菌后，将经等离子体处理后的样品以及未经过处理的对照组细菌溶液，所得悬浮菌液离心处理；然后每个样品取上清液3ml加入到干净试管中，按照上述方法测定每个样品的吸光度值；根据样品所得的吸光度，代入到标准曲线中计算出相对应的蛋白质含量。

等离子体杀菌后的样品中蛋白质含量并不高，本发明灵敏度非常高，最低可以测定1-5μg的蛋白质。

附图说明

图1为蛋白质泄露含量与杀菌效果曲线。

具体实施方式

实施例

在超净工作台中，制备含有大肠杆菌菌种(编号：ATTC25922)的细菌溶液备用。

(1)、配制A、B、C、D、E五种试剂；

A：143mM NaOH与270mM Na₂CO₃

B：57mM CuSO₄

C：124mM Na₂-Tartat

D：A，B，C分别按照98∶1∶1混合

E：Folin-Cioucalteu试剂

(2)牛血清白蛋白标准曲线的制定，由于需要保证测量精度，所以必须根据所测样品中蛋白质的大致含量确定所配置的标准溶液中的蛋白质含量。根据预实验以及其他文献可知，所测蛋白质含量不会超过80μg/mL，故标准曲线中最大蛋白质含量选择100μg/mL，从而保证所测数据的准确性；精确称取的0.0100g结晶牛血清蛋白倒入烧杯中，加蒸馏水溶解后转到100ml容量瓶中定容得到；然后取编号为1-6的试管6只，根据表1中的说明配置不同浓度的蛋白质标准含量溶液，实验中取每种样品3ml至干净的试管中，然后加试剂D 4.2ml，使用漩涡振荡器混合10s后室温下放置10min，然后在所有试管中均加入试剂E0.6ml，立即混合均匀；计时45min以后，将1号试管作为不含蛋白质的对照组，使用分光光度计在750nm波长下测定所有样品的吸光度结果并记录，，注意实验过程中必须操作迅速，而且比色皿必须擦拭干净；然后根据所得结果就能得到蛋白质含量的标准曲线，以牛血清白蛋白含量(μg/mL)为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制出标准曲线。

表1 蛋白质标准含量溶液配置

(3)待测液中蛋白质泄露含量的测定，选用空气微弧等离子体射流作为等离子体发生源，等离子体杀菌后，将经等离子体处理10s、15s、20s、25s、30s后的样品以及未经过处理的对照组细菌溶液，一共6个样品所得悬浮菌液离心处理(6000rpm，10min)，以避免悬浮细胞对测量结果的影响；然后每个样品取上清液3ml加入到干净试管中，按照上述方法测定每个样品的吸光度值；根据样品所得的吸光度，代入到标准曲线中计算出相对应的蛋白质含量。为了便于分析，将样品的杀菌效果与蛋白质含量结果绘制在同一张图中，实验结果见附图1。图1表明，经过空气等离子体射流处理0-30s后，细胞外蛋白质浓度经历了一个先增后减的过程。在0s到20s的过程中，蛋白质浓度逐渐上升，然后随着处理时间的增加而下降。同时发现在0-20s等离子体处理过程中，杀菌效率也是逐渐上升，并且20s处理后所有细菌都被灭活，25s、30s处理后均未检测到存活细胞。在0-20s处理阶段，随着处理时间的增加，细胞死亡数目增多，同时裂解细胞的数目也增多，相应的胞外蛋白质含量也会增多，蛋白质主要来源于破损的细胞膜与胞内物质，然而同时蛋白质本身能与活性物质发生反应从而被破坏，例如蛋白质发生过氧化反应，于是蛋白质的一些氨基酸残基发生改变，三级结构被破坏，降解甚至被分解。因此，蛋白质的增加与减少就存在一个平衡，在20s处理时间时，蛋白质释放量远远超过了蛋白质分解量，此时蛋白质的含量达到了顶峰。在20s处理时间以后，由于细菌全部被杀死，但等离子体仍能作用于细胞结构并破坏细胞结构，只是蛋白质的分解速率超过了释放速率，因此表现为蛋白质含量的下降。另外，需要注意的是，未经过等离子体射流处理的细菌悬浮液中本身存在一定含量的蛋白质，这可能是由于细菌在长时间的处理过程发生死亡裂解现象，或者细菌的一些脂溶性蛋白溶解于水中，甚至是由于悬浮液中存在一定数量的细菌分泌物物造成的。