[发明专利]一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的LAMP方法

说明书

本发明属于蛋白质组学和分子生物学技术领域，具体为一种特异性检测肿瘤标志物黏蛋白（Mucin 1）的LAMP方法。本发明利用mucin 1适配体（mucin 1 aptamer）能特异性结合黏蛋白的性质，把mucin 1 aptamer作为LAMP反应中的F3引物，使其特异性结合Mucin 1黏蛋白，从而根据F3参与LAMP扩增反应后荧光强度来间接检测糖蛋白Mucin 1的含量；其中，本发明设计七组引物，用于LAMP扩增反应；并筛选出一组优化引物，用于对黏蛋白进行灵敏度检测。本发明方法操作简便、特异性高、灵敏度高，通过LAMP核酸扩增方法高灵敏的检测低丰度蛋白含量。

技术领域

本发明属于蛋白质组学和分子生物学技术领域，具体涉及肿瘤标志物黏蛋白（Mucin 1）的LAMP方法。

背景技术

2014年2月5号，世界卫生组织(WHO)发布世界癌症报告，报告显示全球癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势，发展中国家首当其冲，占全球新增病例的6成，年度死亡病例的7成。因此，肿瘤的早期诊断和预防对全世界人民身体保健以及医疗诊断起到举足轻重的作用。而肿瘤标志物是组织中可检测到的与肿瘤的发生、发展有关的物质，因此检测血液中肿瘤标志物的含量，在肿瘤的诊断、分类、预后和复发判断及指导临床治疗中起重要作用。

Mucin1黏蛋白是一种糖蛋白，同时也被证实是一种肿瘤标志物，存在于大量恶性肿瘤中。它在人类表皮细胞肿瘤中是过度表达的，例如直结肠癌，肺癌，前列腺癌，胰腺癌，膀胱癌。而在正常组织中，它的表达量非常低。因此，灵敏的检测细胞表面的肿瘤标志物MUC-1的表达量对早期癌症的检测是非常重要的。核酸适配体是从DNA或RNA文库中筛选出来的能够高特异性和高亲和性与目标蛋白特异性结合的单链寡核苷酸，同时与抗体相比，适配体与靶标分子结合的特异性和亲和力更强，同时具有合成简单快速，易于化学修饰和功能化，而且稳定性好等优点，已经广泛应用于疾病基础研究及诊断治疗。目前，有一些报道利用mucin 1 aptamer检测mucin1黏蛋白及肿瘤细胞，例如利用荧光的mucin 1 aptamer打开方式检测细胞表面mucin 1，利用aptamer-Au-Ag纳米结构的表面增强拉曼效应检测人类乳腺癌，以及利用mucin 1 aptame结合阿奇霉素（Dox）去治疗卵巢癌。这些技术显示了mucin 1 适配体能特异性结合mucin 1糖蛋白，然而，目前这些技术太复杂而且灵敏度低，如能量共振转移（FRET），表面增强拉曼（SERS）及荧光技术。

综上所述，建立一种快速简便，廉价，灵敏度高的MUC-1检测方法是非常重要的。

环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，LAMP的优点包括（1）特异性强（2）等温且灵敏度高。LAMP在等温条件下扩增，不会因温度改变而造成时间的损失，同时与PCR相比，其检测下限很低，仅为几个拷贝。（3）时间短，仅在1h内可把靶序列扩增至10⁹倍。（4）产物易检测。（5）操作简便，因为反应不需昂贵的PCR仪和特殊试剂。同时，目前尚未有将LAMP恒温实时荧光技术应用于快速检测肿瘤标志物MUC-1的报道。

发明内容

本发明的目的在于提出一种高灵敏度特异性检测肿瘤标志物黏蛋白mucin 1的LAMP方法。

本发明提出的高灵敏度检测肿瘤标志物黏蛋白mucin 1的LAMP方法，包括LAMP引物设计，检测肿瘤标志物黏蛋白mucin 1的试剂盒设计，以及检测流程设计。

本发明首先设计LAMP引物，以MUC-1 aptamer 作为 LAMP引物组中的F₃引物，同时利用primer designer 软件设计七组引物（B₃，BIP，FIP），分为外引物B₃和F₃， 内引物FIP和内引物BIP，其引物序列分别如下所示：