[发明专利]人源化抗C-MET 拮抗剂

权利要求书

1.抗c-met抗体，其包含：

(a)至少一种选自下组的HVR序列：

(i)包含序列A1-A17的HVR-L1，其中A1-A17是KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO:1)

(ii)包含序列B1-B7的HVR-L2，其中B1-B7是WASTRES(SEQ ID NO:2)

(iii)包含序列C1-C9的HVR-L3，其中C1-C9是QQYYAYPWT(SEQ ID NO:3)

(iv)包含序列D1-D10的HVR-H1，其中D1-D10是GYTFTSYWLH(SEQ ID NO:4)

(v)包含序列E1-E18的HVR-H2，其中E1-E18是GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO:5)

(vi)包含序列F1-F11的HVR-H3，其中F1-F11是XYGSYVSPLDY(SEQ ID NO:6)且X不是R；及

(b)至少一种变体HVR，其中所述变体HVR包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6中所示序列的至少一个残基的修饰。

2.抑制c-met激活的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的权利要求1的抗体。

3.调节与HGF/c-met信号轴调控异常有关的疾病的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的权利要求1的抗体。

4.治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的权利要求1的抗体。

5.治疗受试者中增殖紊乱的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的权利要求1的抗体。

6.编码权利要求1的抗体的核酸。

7.包含权利要求6的核酸的宿主细胞。

8.包含权利要求1的抗体的组合物。

9.构建噬菌体文库的方法，包括下述步骤：

使用的噬菌粒是具有在phoA启动子控制下的2个可读框的单价Fab-g3展示载体(pV0350-2B)，基本上如Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-93(2004)中所述；第一个可读框由与受体轻链VL和CL结构域融合的stII信号序列组成，而第二个由与受体重链VH和CH1结构域融合的stII信号序列及随后的截短的次要噬菌体外壳蛋白P3组成；

将来自由ATCC保藏号HB-11895的杂交瘤5D5.11.6生成的鼠5D5的VL和VH结构域与人共有κI(huKI)和人亚型III共有VH(huIII)结构域进行比对；为了进行HVR移植，使用在3个位置：R71A、N73T和L78A与人亚型III共有VH结构域不同的受体VH框架；将来自鼠5D5(mu5D5)的高变区移植到受体人共有框架中以生成5D5的直接HVR移植物(5D5移植物)；在VL结构域中，将下列区域移植到人共有受体中：位置24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)。在VH结构域中，移植位置26-35(H1)、49-65(H2)和95-102(H3)；

直接移植变体是通过Kunkel诱变生成的，对每个高变区使用了个别的寡核苷酸；通过DNA测序评估了正确克隆；

使用维持倾向于小鼠高变区序列趋势的模糊随机化(soft randomization)策略将序列多样性引入各个高变区；这是使用中毒寡核苷酸合成策略(poisoned oligonucleotide synthesis strategy)实现的，如Gallop et al.,J.Med.Chem.37:1233-1251(1994)所述；对于待突变高变区内的指定位置，用70-10-10-10的核苷酸混合物使编码野生型氨基酸的密码子中毒，导致各个位置的平均50％突变率；

以模糊随机化寡核苷酸模仿鼠高变区序列，且涵盖由直接高变区移植物所限定的相同区域。通过使用密码子RGC将VH结构域中H2起始处(第49位)的氨基酸位置在序列多样性上限定为A、G、S或T；

将为各个高变区设计的随机化寡核苷酸集合分开在六份含660ng寡核苷酸、50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、1mM ATP、20mM DTT和5U多核苷酸激酶的20μl反应液中于37℃磷酸化1小时；然后将这六份磷酸化寡核苷酸集合与20μg Kunkel模板在50mM Tris pH 7.5,10mM MgCl2中混合，终体积500μl，导致寡核苷酸与模板的比率为3；将混合液在90℃退火4分钟，50℃5分钟，然后在冰上冷却；使用QIAQUICK PCR纯化试剂盒(Qiagen kit 28106)以改良方案清除过量的未退火寡核苷酸以防止已退火DNA的过度变性；向500μl退火混合液中加入150μl PB，并将混合液分到2个硅土柱上；用750μl PE清洗各个柱并将柱额外甩干后，用110μl 10mM Tris,1mM EDTA,pH 8洗脱各个柱；然后将已退火并经清洗的模板(220μl)通过添加1μl 100mM ATP,10μl 25mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各25mM),15μl 100mM DTT,25μl 10X TM缓冲液(0.5M Tris pH 7.5,0.1M MgCl2)、2400U T4连接酶和30U T7聚合酶在室温补平3小时；

在Tris-醋酸盐-EDTA/琼脂糖凝胶上分析补平产物；

然后清洗补平产物并电穿孔进入SS320细胞，并在存在M13/KO7辅助噬菌体时繁殖，如Sidhu et al.,Methods in Enzymology 328:333-363(2000)所述。