[发明专利]采用谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法

说明书

 技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种氨基酸耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法。

背景技术：

被称为“超级病菌” 的耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌,

(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus , MRSA)在各国的传播越来越迅速,已经严重威胁到人类的健康和生命。临床上只有万古霉素(Vancomycin)对MRSA有抑制作用, 随着万古霉素在MRSA感染中应用的增加,临床上已出现了感染的金黄色葡萄球菌对万古霉素敏感度减为中度敏感的现象 。   

达托霉素(Daptomycin)被公认为在万古霉素之后的最佳备用抗生素,是美国礼莱公司20世纪80年代发现的新型脂肽类抗生素,对MRSA有明显的抑制作用, 除抗MRSA之外,达托霉素还对绝大多数的革兰氏阳性菌有抑制作用。据报道,达托霉素对2002 ～ 2005年从美国和加拿大各医院收集的19615株临床革兰氏阳性菌中的99%存在抑制作用。达托霉素在生物膜中的扩散速度远远超过一般药物，因此作用速度快且具浓度依赖性，可产生抗生素后效应，不易与其它抗生素产生交叉耐药性。自从2003年9月FDA(美国食品与药物管理局)首次批准Cubicin(Daptomycin 注射剂)用于治疗复杂皮肤和皮肤结构感染以来, 达托霉素在临床上应用越来越多, 市场上对达托霉素的需求量越来越大。达托霉素由13个氨基酸组成，其中左侧10个氨基酸形成一个肽环，位于右侧的3个氨基酸组成了环外的尾巴。13个氨基酸有两个属于非天然氨基酸：犬尿氨酸(Kyn)和3-甲基谷氨酸(3mGlu)，它们仅存在于达托霉素中。目前由于3-甲基谷氨酸原料的缺乏，用化学合成或化学与酶结合催化的方法改造达托霉素母核很困难。

发明内容：

本发明的目的是提供了一种培养基原料来源广，成本低，出发菌株正突变株的几率高、突变株达托霉素效价高的谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法。

本发明是这样实现的：

采用谷氨酸钠耐受性模型筛选达托霉素高产菌株的方法，包括如下步骤：

（1）初筛：将诱变处理的玫瑰孢链霉菌单孢子悬浮液稀释后涂布于含有谷氨酸钠耐受量为150—200 g/L的分离培养基上，在30℃培养箱中培养7—10天，挑选耐谷氨酸钠的玫瑰孢链霉菌单菌落接种于斜面培养基上，30℃培养7—10天，斜面产孢后接种于种子培养基中，30℃培养48h后接种于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价高的玫瑰孢链霉菌菌株；

（2）复筛：将效价较高的玫瑰孢链霉菌菌株接种于种子培养基中，30℃培养48h后，挑选菌丝生长良好的菌株接种于含谷氨酸钠量不同的发酵培养基中，30℃培养168h后测定效价；

（3）发酵培养基试验：将效价较高的玫瑰孢链霉菌菌株进行发酵培养基试验，将（2）中培养好的玫瑰孢链霉菌种子接到含谷氨酸钠量不同的的发酵培养基中，接种量为5%，V/V，30℃培养168h后测定效价，挑选出效价高的玫瑰孢链霉菌菌株即成，或者将（2）中培养好的玫瑰孢链霉菌种子接到含谷氨酸钠量为3或5或10或15 g/L的发酵培养基中，接种量为5%，V/V，30℃培养168h后即成。

所述的（1）步骤中所用分离培养基成分和含量为：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，谷氨酸钠150 g/L，琼脂15.0 g/L ，pH7.2-7.4。

所述的（1）步骤中所用斜面培养基成分和含量为：可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸镁1.0 g/L，硝酸钾1.0 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，氯化钠0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，琼脂15.0 g/L， pH7.2-7.4。

所述的（1）、（2）和（3）步骤中所用的种子培养基成分和含量为：糊精15 g/L，葡萄糖5 g/L，花生饼粉5 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨5 g/L，磷酸氢二钾 0.5 g/L，硫酸镁0.2 g/L，硫酸亚铁0.004 g/L ，pH7.5 。

所述的（1）、（2）和（3）步骤中所用的含谷氨酸钠量不同的发酵培养基含谷氨酸钠分别为3.0 —15 g/L中之一，其他成分和含量均为：糊精35 g/L，葡萄糖5 g/L ，黄豆饼粉22 g/L，硫酸钾5 g/L， pH7.5。