[发明专利]人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA序列、分离方法及其用途

说明书

本发明涉及人宫颈癌转移相关的新长链非编码RNA序列、可用于RNA干扰的靶点序列、编码干扰靶点的短发夹序列、及含有长链非编码RNA序列的RNAi靶点序列、shRNA短发夹核酸序列重组载体和重组子，本发明还涉及了该新长链非编码RNA序列的分离方法及其用途。本发明的长链非编码RNA序列基是通过生物信息学方法，从宫颈癌相关的cDNA文库中通过RACE扩增得到，通过测序、杂交、细胞增殖、细胞侵袭等试验，验证了该RNA序列的功能及其用途；设计该序列特异性的RNAi用shRNA、siRNA序列及重组载体，并验证了siRNA、shRNA的功能。本发明提供的长链非编码RNA序列、RNAi干扰靶点、shRNA短发夹序列在宫颈癌的早期诊断和治疗上具有重要意义。

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，具体涉及一个长链非编码RNA基因序列、该序列分离方法、该基因RNA干扰靶序列、RNA干扰用短发夹片段及其用途。

背景技术

宫颈癌是全球女性中仅次于乳腺癌和结直肠癌的第三常见的恶性肿瘤，在发展中国家仅次于乳腺癌，是最常见的女性生殖系统恶性肿瘤之一。近年来，由于环境污染、社会工作压力加大以及生活中的不良卫生习惯等因素，宫颈癌发病率有明显上升的趋势，且患者年轻化趋势越来越明显，其中85％新发病例在发展中国家，因此对宫颈癌研究具有良好的社会价值。

肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，大多数癌症患者并非死于原发性癌而是死于转移性癌。目前宫颈癌的早期诊断使得宫颈癌的治疗效果及预后情况有了很大的改善，但是肿瘤的转移依旧是宫颈癌术后治疗的一个高危因素，据文献报道宫颈癌患者5年生存率为80％-98％，若并发淋巴结转移5年生存率则骤降至50％以下。目前广泛性子宫切除及盆腔淋巴结清扫术为治疗早期宫颈癌的标准术式，但部分宫颈癌患者早期并无淋巴结转移，而且盆腔淋巴结清扫手术可导致多种并发症。因此运用宫颈癌浸润和转移有关的分子生物学指标，可更全面的预判淋巴结转移的可能性，从而辅助早期诊断与选择手术治疗方案、提高患者预后。

肿瘤的发生就其本质上来说是由基因决定的，在使用放疗和化疗这种杀伤性治疗方法的同时，人们从未放弃过对肿瘤基因治疗的探索。RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是目前基因治疗策略中非常重要的一个手段，短RNA序列与其互补的RNA靶点结合后会导致该RNA序列的降解，从而抑制其生物学功能。目前在生物体内实现RNA干扰的两种方式为利用载体表达短的发夹状RNA(short hairpin，shRNA)与注入化学合成小干扰RNA(smallinterfering，siRNA)，但两者前提均是找到有效的干扰位点，从而才能实施有效的基因干预。自2004年美国FDA首次批准用于黄斑病的RNA干扰药物Cand5进入临床实验以来已有大量的RNA干扰药物被批准用于临床实验，其数量还在持续增加。RNA干扰技术的高特异性与高效性均使基因治疗手段进入了一个新的时代，其发明者也因此于2006年获得诺贝尔生理及医学奖。综上所述，筛选肿瘤相关的关键基因，找到其有效的干扰靶点开发出RNA干扰药物将是基因治疗研究领域中一个重要的发展方向。

长链非编码RNA(Long noncoding RNA，lncRNA)是指长度大于200个碱基且不编码蛋白的RNA，种类繁多，结构各异，以RNA转录本的形式行使其生物学功能，参与细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程，几乎影响所有生理和病理过程。最近的研究表明lncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，已经发现lncRNA与肺癌、非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病直接关联。大量的研究表明lncRNA在生物进化上极不保守，组织及发育时期的表达特异性明显高于蛋白编码基因，以肿瘤相关的lncRNA作为靶点进行基因干预治疗其可能带来的副作用将会小于蛋白编码基因靶点，肿瘤相关lncRNA的发现可能会对肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。

长链非编码RNA与RNA干扰技术均是肿瘤基因治疗研究方面的热点，找到宫颈癌异常表达的长链非编码RNA有助于更好的进行宫颈癌的早期诊断与辅助治疗，并可通过抑制其表达进行基因治疗，具有重要的实用价值。

发明内容